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    細胞免疫檢測技術

    關鍵詞: 細胞 免疫檢測 技術來源: 互聯網

    特異性細胞免疫是由T細胞介導的,因此,細胞免疫檢測通常是檢查T細胞的數量、功能及其產物如細胞因子等,是了解機體細胞免疫狀態的重要手段。 一、淋巴細胞的分離 細胞免疫檢測首先要從人或動物血液及組織中分離出活的淋巴細胞。分離淋巴細胞的方法有多種,目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離外周血單個核細胞。 分離人外周血單個核細胞(PBMC)的分層液是比重1.077±0.001的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分層液。紅細胞、粒細胞比重大,離心后沉于管底;淋巴細胞和單核細胞的比重小于或等于分層液比重,離心后漂浮于分層液的液面上,也可有少部分細胞懸浮在分層液中。吸取分層液液面的細胞,就可從外周血中分離到單個核細胞。 【 材料 】肝素抗凝人血、淋巴細胞分層液、無Ca 2+ 、Mg 2+ Hanks液、離心管、試管、吸管、毛細管、白細胞計數板。 【 方法 】 (1)采取新鮮靜脈血2ml,加入含0.1ml肝素(50單位)的試管中,加2mlHanks液混勻。 (2)用滴管將稀釋過的血液沿管壁緩慢加入2ml細胞分層液的液面上(分層液與稀釋血液體積比例為1:2),注意兩者不能混合,保持界面清楚,用水平離心機以2000轉/分,離心20分鐘,離心完,可見紅細胞沉降至最下層,上層為血漿,中層為分層液,血漿與分層液的界面有一比較清楚的乳白色淋巴細胞和單核細胞層 (見圖4-1)。用毛細滴管吸取該層,置含有1滴肝素及5倍以上體積無Ca 2+ 、Mg 2+ Hanks液的試管中,以2000轉/分離心10分鐘,棄上清液后,以同樣試液再洗滌一次。 (3)盡量吸去上清液,將沉于管底的細胞沉積塊搖散,加Hanks液至1ml作細胞計數,用Hanks液配成2×106細胞/ml的細胞懸液。

    二、E花環形成試驗(erythrocytc rosette forming test) 人類T淋巴細胞表面CD2分子是綿羊紅細胞(SRBC)受體,也稱E受體,在一定條件下,SRBC環繞T細胞與之結合,形成花環狀,稱E花環(E-rosette),形成此種花環的細胞稱E花環形成細胞(簡稱E-RFC)。 E花環試驗可用作人外周T細胞的分離與鑒定。 【 材料 】淋巴細胞懸液、1%SRBC懸液、滅活之小牛血清、離心管、試管、吸管、載玻片、0.8%戊二醛、瑞氏染液。 【方法】 (1)取上述配好之淋巴細胞懸液0.1ml于潔凈小試管中,加入1%SRBC懸液0.1ml。再加入小牛血清0.1ml,混勻,置37℃水浴箱中5分鐘,500轉/分,離心5分鐘,放4℃冰箱2-24小時。 (2)從冰箱中取出試管,留適量上清液,輕輕搖勻,加0.8%戊二醛2滴,輕搖后,置4℃冰箱15分鐘,取出,作成涂片,待自然干燥,以瑞氏染液染色。 (3)計數:鏡下觀察,凡結合三個以上SRBC的T細胞即為E-RFC,計數200個淋巴細胞,求出E-RFC占淋巴細胞總數的百分率。 【 結果 】 一般認為E-RFC的正常值在60%以上,如少于50%則為低下。如欲分離T細胞,可用密度梯度離心,E-RFC因比重增大而沉于管底,與其他細胞分離;用低滲法裂解花結中的SRBC,即可獲得純化的T細胞。 三、淋巴細胞轉化試驗(微量全血法 ) T細胞在體外培養時,當受到非特異性的有絲分裂原(PHA)刺激后可轉化為淋巴母細胞,并進行有絲分裂,轉化的淋巴母細胞,在形態上出現了幼稚化,光鏡下很容易識別,可通過淋巴細胞轉化率反映機體T細胞免疫功能。此試驗也可用3H-TdR摻入法或MTT法定量檢測。

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