基因工程抗體細胞質表達 ? ??? 胞內表達抗體主要采用高表達方式，其表達結果因抗體片段的不同而有較大差異，主要取決于翻譯起始位點的設計、片段對蛋白酶的敏感性和宿主菌。高表達抗體的結果常常是以包涵體(inclusion body)形式存在，除載體方面的原因外，這可能與抗體表面疏水性強有關。包涵體可以防止宿主對抗體的降解，并利于純化。經過變性、復性及去除蛋白的N端甲酰甲硫氨酸或甲硫氨酸，可以得到重新折疊的有抗原結合活性的天然分子。對于不同的蛋白，復性條件是不同的。 ? 【材料和試劑】 ?? （1）大腸桿菌XL1-Blue。 ?? （2）載體pROH80，攜帶谷胱甘肽轉移酶基因(GST)，能與插入的抗體基因表達出融合蛋白(GST-ScFv)。 ?? （3）抗膀胱癌McAb重鏈(VH)366bp和輕鏈(VL)324bp基因，連接肽為(GGGGS)3。 ?? （4）超聲儀（Cole Parmer4710)。 ?? （5）IPTG。 ??? (6) 包涵體溶解液：0.2mol/L Tris-HCl pH8.2、0.1mmol/L β-巰基乙醇。 ? 【操作步驟】 ??? (1)將VH、VL基因分別插入載體pROH80的克隆位點，構建成單鏈抗體ScFv，轉化XL1-Blue感受態細胞，篩選的陽性克隆用酶切鑒定。 ??? (2)接種單菌落(含pRS80)于2ml LB培養基(含Amp 0.1mg/ml)，37℃培養過夜。次日，1：100稀釋加至LB中，37℃培養3～4h，至OD600 約1.5時，加入0.1～1mol/L IPTG，轉至30℃誘導4～6h。 ??? (3)將培養的菌液于4000r/min離心10min，收集菌體，重懸于PBS中，超聲破碎細胞(duty circle 30％，output 4，20min)，12 000r/min離心20min，收集沉淀物。 ??? (4)將沉淀物用3mol/L尿素、25mmol/L Tris-HCI pH8.0? 10mmol/L EDTA溶液洗滌5次，每次12 000r/min離心20min，收集沉淀。 ??? (5)用包涵體溶解液(0.2mol/L Tris-HCl pH8.2、0.1mmol/L β-巰基乙醇)懸浮沉淀，定溫3～5h，待溶液清澈透明，1000r/min離心20min，收集上清。 ??? (6)將變性的包涵體蛋白用6mol/L尿素、2.5mmol/L Tris-HCl pH8.0，lmmol/L EDTA，5mmol/L DTT溶液透析，4℃。 ??? (7)透析過的包涵體溶液經DE-52離子交換柱洗脫，紫外檢測收集蛋白峰，經15％SDS-PAGE電泳檢測純度。 ??? (8)對收集的蛋白溶液，用3mol/L尿素、25mmol/L Tris-HCl pH8.0、1mmol/L氧化型谷胱甘肽、0.1mmol/L還原型谷胱甘肽溶液稀釋至蛋白濃度為0.1mg/ml，室溫復性24～48h。