Protocol of Northern blot 質粒的轉化和擴增 質粒的鑒定 目的基因片段的切割 3.1樣品雙酶切(175μl水解體系) DW 115μl Buffer B(10×) 17.5μl BaM H 15μl Pst I 17μl DNA(MMP-9) 16μl BSA 4.5μl 37℃水浴，3h。 3.2制膠(1.5%Agarose) 0.6g Agarose+40ml TAE(1×) 3.3電泳 175μl樣品+35μl loading buffer(6×) Marker 5μl +DW 20μl + 5μl loading buffer(6×) 3.4目的基因片段的回收（按照北京鼎國生物發展中心的DNA純化回收手冊進行） 3.4.1 切取含DNA片段的瓊脂糖（100mg-300mg）搗碎按重量比1：3（DNA片段：溶液B）加入溶液B。 3.4.2 50℃水溶10分鐘，直至膠完全溶化，其間旋渦振蕩三次，瓊脂糖必須完全溶化，如果體積大于500μl，可適當增加溶膠時間，若此時溶液變紅，可加15μl NaAc。（亦可不加）。 3.4.3 將溶液置于離心柱中，靜置1-2分鐘，≥8000rpm離心30S-60S，若一次加不完，可分兩次離心。 3.4.4 倒掉液體，加入500μl溶液C（用無水乙醇1：1稀釋）于離心柱中，8000rpm 30-60S離心，倒掉液體。 3.4.5 用溶液C（用時乙醇1：1稀釋）500μl再洗一遍，8000rpm 離心30-60S。 3.4.6 ≥15000rpm再次離心30S-60S，摔干剩余液體。 3.4.7 將離心柱置于新的離心管中，（此時若離心管蓋蓋不住，不影響實驗結果）加入≥50℃預熱30-50μl（取最低值）溶液D，混勻，靜置2分鐘，≥15000rpm離心60S，管底即DNA。 3.4.8 將DNA貯存于-20℃。 3.5目的基因片段的鑒定 3.5.1電泳（看是否為一條帶） 3.5.2 OD值的測定（主要是確定濃度和質量） 子宮組織總RNA的提取（采用Trizol提取法） 4.1勻漿 每50-100mg組織加入1mlTRIzol。樣品體積不能超過10%TRIzol體積。勻漿。此步后加入氯仿前可放于-60℃～-70℃至少一個月。 4.2可選（對富含脂肪、蛋白的樣品而言） 2-8℃，12000rpm，10分鐘。取上清，移入新管。 4.3水相分離 15-30℃孵育5分鐘。然后，加入0.2ml氯仿（每1mlTRIzol）。用力搖15秒，15-30℃孵育2-3分鐘。2-8℃，12000rpm，15分鐘。離心后，RNA在水相。 4.4 RNA沉淀 轉移水相入新管（注意，保留有機相用于DNA和蛋白的提取），加入0.5ml異丙醇（每1mlTRIzol），15-30℃孵育10分鐘。2-8℃，12000rpm，10分鐘。可見RNA沉淀。 4.5 RNA洗滌 棄上清，每1mlTRIzol加入至少1ml 75%乙醇清洗一次沉淀。2-8℃，7500rpm，5分鐘。 4.6溶解RNA 室溫干燥RNA 5-10分鐘。加入100μl DEPC水重溶RNA。貯存于-70℃。 4.7 RNA的鑒定 測定OD260/280，1.7～2.0為好；電泳，觀察降解與否，照相。 RNA變性凝膠電泳 5.1制膠 溶化適量Agarose于水中，冷卻至60℃，加入5×甲醛凝膠緩沖液（即5×MOPS：0.1M MOPS，40mM乙酸鈉，5mM EDTA）和甲醛（PH＞4.0）至最終濃度分別為1×和2.2M。將膠放在制膠板中，室溫至少30min。 Agarose 0.4g 去離子水 25ml 60℃溶解后，再加入： 5×MOPS 8ml 甲醛 7.3ml 5.2制備樣品 RNA 4.5μl（約10~20μg，RNA體積不足用DEPC水補齊） 5×MOPS 2.0μl 甲醛（約占20%） 3.5μl 去離子甲酰胺（占50%） 10.0μl 65℃孵育樣品15min，冰上制冷，離心（樣品）5秒，將所有液體沉淀到微型離心管中。 5.3 加1/10體積（2μl）的無菌、DEPC處理的甲醛凝膠上樣緩沖液（50%甘油，1mmol/L EDTA,0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF）。 5.4 預電泳5V/cm，5分鐘，電泳緩沖液為1×MOPS，預電泳后立即加入樣品。 5.5 電泳緩沖液1×MOPS淹沒凝膠，電壓3~4V/cm（80V，1.5~4h可根據溴酚藍的位置來確定電泳時間，基本上溴酚藍快跑完了） 6．轉膜 6.1 電泳完畢后，用DEPC水清洗5min×3，以去除甲醛，然后浸泡凝膠于20×SSC中45分鐘。 6.2 浸泡尼龍膜于20×SSC中，至少5分鐘。 6.3濕式電轉移 6.3.1將8張合適大小的濾紙、尼龍膜及海綿在電泳緩沖液（0.5×TBE）中浸透（至少10分鐘）。 6.3.2將膠安放在轉移架夾中，注意不要留下氣泡。安放順序為：海綿、4張濾紙（一張一張放，并用吸管及時除去氣泡）、凝膠、尼龍膜、4張濾紙（每放一層都用0.5×TBE濕潤一下）。將轉移架夾緩緩地放置在裝有電泳緩沖液的轉移槽中，使液體慢慢沒夾，驅出海綿中的氣泡。注意：尼龍膜面向正極柵板。 6.3.3轉移：電壓為1-4V/CM。先用8V（1V/CM）轉移1小時，小片段在低電壓下轉移較好。然后升壓至30V（4V/CM），再轉移2小時，使大片段轉移徹底。通過紫外光可檢查轉移效果。 6.3.4結束轉移，取出尼龍膜，在電泳緩沖液中漂洗可能粘附的凝膠，浸泡膜于2×SSC中至少5分鐘（5~30min）。 6.3.5紫外交聯，在基因交聯儀中進行，設定如下參數： 濕膜：150mj，13秒，C3 干膜：13秒，C2 如需重復雜交時，勿讓膜干透。 7．cDNA的32P末端隨機引物標記 7.1 變性25ngDNA（適當增大加入量）溶解在5~20μl 蒸餾水中，沸水浴加熱5min，然后立即冰上制冷。 7.2 冰上進行以下操作： 2μl dATP 2μl dGTP 2μl dTTP 10μl 隨機引物緩沖液（Random Primer Buffer） 3μl(約50μCi，[α-32P]dCTP，Mixture)3000Ci/mmol,10μCi/μl 加蒸餾水至總體積49μl，短暫振蕩。 7.3 加入1μlKlenow片段，緩慢且完全混勻，短暫離心。 7.4 25℃溫育1h。 7.5加入5μl終止液。直接用于雜交反應或放于-20℃以備使用，但不可放置太久。 附注：第4步中孵育時間大于1h可以產生較高的特異性。 第5為得到理想結果，超螺旋DNA應在隨機引物標記前線粒化或堿變性。 8．雜交 8.1 室溫浸泡膜于2×SSC中15分鐘。倒掉液體，加入7.5ml預雜交液。65℃預雜交4h。 8.2 沸水浴200ng cDNA探針（于50μl緩沖液中）5~15分鐘，然后立即在冰水混合物中致冷。離心。 8.3 倒掉預雜交液，加入10ml新鮮配置的雜交緩沖液，內含10%硫酸葡聚糖（dextran）以及32P標記的探針（每次10ml雜交液中加入5μl 32P標記探針）。垂直放入雜交管底部，搖勻。65℃，在雜交爐中轉動雜交25（＞16）小時。 8.4 自然冷卻至室溫，洗膜30分鐘（雜交爐中轉動），洗膜液Ⅰ為1×SSC，0.1%SDS。 8.5 60℃，洗膜液Ⅱ中洗膜3×30分鐘（雜交爐中轉動）。 9．放射自顯影 吸干多余的液體，包上可透過紫外線的塑料保鮮膜，在暗室中將雜交膜和X光片放入增感屏內，密封后放在-80℃中，48小時。 10．顯影和定影 暗室中顯影13分鐘，定影30分鐘。 11．洗掉探針 用50mL洗膜液Ⅲ于65℃，2×30分鐘。用2×SSC室溫漂洗5min×2。 Northern Blot 實驗過程中所用到的試劑配方： ―――――雜交前―――― 1．5×MOPS，500ml 0.1M MOPS 0.04M NaAc 0.005M EDTA 在400mL的DEPC水中溶解11.56g MOPS，用HAc或NaOH調節PH至7.0，然后加入2.72g NaAc及5mL 0.5M EDTA，用DEPC水定容至500mL，用0.22μm的濾膜過濾除菌，避光保存。 2．0.5M EDTA（PH8.0），50 mL EDTA 7.306g DEPC水 45mL 用NaOH調至PH8.0，補加DEPC水到50 mL 3．甲醛凝膠上樣緩沖液（約20μL，即 loading buffer） 50% 甘油 1mM EDTA（PH8.0） 0.25% 溴酚藍 0.25% 二甲苯青FF 4．1×MOPS，500mL 5×MOPS 100mL DEPC水 400mL 5．20×SSC，1000mL 3M 175.3g NaCl 0.3M 88.2g 檸檬酸三鈉?2H20（88g/L） 用1M HCL調PH7.0，定容到1000mL 6．2×SSC，500 mL 20×SSC 50mL DEPC水 450 mL 7．5×TBE ，400mL 21.6克 Tris堿 11.0克 硼酸 8mL 0.5M EDTA PH8.0 加DEPC水至400mL，出現沉淀后廢棄。 8．1×TBE，1000mL 10×TBE 100mL DEPC水 900mL ――――――雜交時――――― 1．2×SSC 2．預雜交液，50mL DEPC水 30mL SDS 3.5g Na2HPO4?12H2O 2.45g NaH2PO4(NaH2PO4?2H2O) 0.38g(0.494g) 0.5M EDTA 100μL BSA 0.5g 去離子甲酰胺 7.5mL 加無離子水至50mL ――――――雜交后―――――― 1．洗膜液Ⅰ，500mL 1×SSC 500mL 0.1%SDS 0.5g 2．洗膜液Ⅱ，2000mL(500mL) NaH2PO4?2H2O 2.465g (0.62g) 25mM Na2HPO4?12H2O 12.248g (3.06g) 25mM EDTA 0.584g (0.146g) 1mM SDS 20g (5g) 1% 加水至 2000mL (500mL) 3．洗膜液Ⅲ，500mL Na2HPO4?12H2O(10mM) 1.79g DW to 250mL 約1mL磷酸調PH7.0 去離子甲酰胺(50%) 250mL