RNA干涉（RNAi）是指雙鏈RNA分子使基因表達沉寂的現象，是在線蟲中發現的，在 1998年的一篇Nature論文中被公諸于眾。過去幾年中，科研工作者已明確轉錄后基因沉默現象普遍存在于動、植物中，在機體防御病毒入侵和轉座子沉默效應中起著重要作用。 近年來的研究表明，將與mRNA對應的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA(dsRNA)導入細胞，可以使mRNA發生特異性的降解，導致其相應的基因沉默。 RNAi的分子機制 ? ? 通過生化和遺傳學研究表明，RNA干擾包括起始階段和效應階段(inititation and effector steps)。在起始階段，加入的小分子RNA被切割為21-23核苷酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs, siRNAs)。證據表明；一個稱為Dicer的酶，是RNase III家族中特異識別雙鏈RNA的一員，它能以一種ATP依賴的方式逐步切割由外源導入或者由轉基因，病毒感染等各種方式引入的雙鏈RNA，切割將RNA降解為19-21bp的雙鏈RNAs(siRNAs)，每個片段的3’端都有2個堿基突出。 ? ? 在RNAi效應階段，siRNA雙鏈結合一個核酶復合物從而形成所謂RNA誘導沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC）。激活RISC需要一個ATP依賴的將小分子RNA解雙鏈的過程。激活的RISC通過堿基配對定位到同源mRNA轉錄本上，并在距離siRNA3’端12個堿基的位置切割mRNA。盡管切割的確切機制尚不明了，但每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶。 ? ? 另外，還有研究證明含有啟動子區的dsRNA在植物體內同樣被切割成21-23nt長的片段,這種dsRNA可使內源相應的DNA序列甲基化,從而使啟動子失去功能,使其下游基因沉默. RNAi技術的應用 1． 功能基因組和遺傳學應用 隨著各種模式生物和人類基因組測序的完成，基因功能的研究遠遠落后于大量序列所提供的信息，研究和發現基因功能成為越來越緊迫的任務。長期以來，破壞基因結構或抑制基因表達是研究基因功能的重要方法，如常用的基因敲除技術( gene knock out) 。基因敲除技術要求對所研究的基因序列要有詳細的認識比較費時費力。自RNAi 現象發現后，因其操作簡單、特異性高、能迅速而方便地使某個基因失去功能等優點 獲得了生物學家的青睞而首先被應用于功能基因組和反向遺傳學的研究。RNAi 技術還具有一個優勢 能同時封閉多個基因或基因家族 用于研究mRNA 差別剪接形成的異構體；甚至在基因組水平上構建針對基因組的RNAi 表達載體，用于研究基因之間的相互作用和進行基因功能的高通量篩查。相對于基因敲除技術可破壞基因的完整性，RNAi 技術僅僅使基因表達暫時降低，基因組的信息仍是完整的。利用RNAi 技術先封閉基因的表達，然后再激活，通過前后表型的變化，能方便地鑒定出基因的功能。 RNAi 技術為研究發育過程中基因的功能提供了一個手段，能很容易地制造出突變型個體。Amdam 等把dsRNA 注入囊胚前期的蜜蜂卵或初生蜜蜂腹內中，封閉vitellogenin 基因的表達(vitellogenin 基因在成體后才出現表型)，結果分別有15%和96%的個體出現突變型。15 天后，仍能檢測到dsRNA 片段。在進行反向遺傳學研究時，RNAi 技術也能用來尋找藥物治療靶點。Makimura 等利用RNAi 技術減少了丘腦下部AGRP(agouti-relatedpeptide) 50%的表達量，AGRP 使代謝率提高而不減少攝食量，從而減輕肥胖，為肥胖的治療提供了一個靶點。為了明確Fas 信號通路在肝臟疾病中的作用，在小鼠模型中，利用RNAi 技術抑制Fas 的表達能明顯降低自身免疫性肝炎引起的肝衰竭和纖維化，說明Fas 在肝臟疾病中所起的作用。 2. 基因治療 ? ???反義核酸技術常用于基因治療的研究。反義核酸技術沒有放大作用，需要大量核酸，效果不持久。Bert rand 等研究表明，在培養的HeLa 細胞中分別轉入反義寡核苷酸(AS-ODN) 和siRNA ，結果si-RNA 比AS-ODN 能更有效地抑制基因表達。在異種移植小鼠體內實驗表明，siRNA 在體內能抑制基因表達，但AS-ODN 因其對核糖核酸酶抵抗性低，不能引起有效的基因表達抑制。RNAi 技術能使特異的基因封閉，阻止病原體的繁殖與傳播；利用其特異性，抑制顯性等位基因或突變基因的表達，甚至單核苷酸多態性，治療腫瘤和遺傳性疾病。RNAi 只抑制致病基因，而不影響正常等位基因的功能，具有較高的選擇性和特異性，能減少非特異作用引起的副作用。目前的研究主要針對病毒性疾病和腫瘤性疾病。 3. 病毒性疾病 ? ???主要集中在對人類威脅性較大的肝炎病毒和人類免疫缺陷病毒。已有研究表明利用RNAi 技術，在體外培養細胞中能抑制乙型和丙型肝炎病毒的復制。在體內實驗中，把siRNA 注入丙型肝炎小鼠后，也能阻止病毒的復制，在慢性肝炎的治療中顯示出很大的潛力 。在急性肝衰竭的小鼠模型中，利用RNAi 來抑制caspase 8 的表達，阻止Fas 介導的凋亡，能明顯延緩病情進展，提高生存率。Coburn 等針對HIV-1 的Tat 和Rev 基因設計并合成siRNA ，特異性地抑制Tat 和Rev 的表達。在培養的T 細胞和淋巴細胞中，siRNA 能抑制HIV-1病毒基因的表達和復制，從而能阻止病毒的傳播。在流感病毒中，利用RNAi 技術也取得了較好的抑制病毒復制的效果。 4. 腫瘤性疾病 腫瘤是威脅人類生命的重大疾病之一，在腫瘤的綜合治療中，基因治療日益受到重視。腫瘤是一種多基因疾病，針對單個基因的基因治療一般不能取得好的效果。RNAi 技術可以針對信號通路的多個基因或者基因族的共有序列來同時抑制多個基因的表達，從而能更有效地抑制腫瘤生長。針對慢性粒細胞白血病的融合基因設計siRNA ，明顯地抑制了體外培養細胞中融合基因的表達，促進白血病細胞的凋亡。Cioca 等利用粒細胞白血病細胞系研究了Raf-1 和bcl-2 基因在白血病中的作用，表明RNAi 能誘導細胞凋亡并能提高腫瘤細胞對化學治療的敏感性。血管內皮生長因子(VEGF) 在腫瘤的發生發展中起重要作用，已成為腫瘤治療的新靶點。Zhang 等利用DNA 表達載體來合成鼠VEGF 不同異構體siRNA ，特異性地封閉了大分子量VEGF 的表達，有效地抑制腫瘤細胞的生長。β-連環蛋白和APC 基因是Wnt 信號通路中的重要組分，突變后引起細胞異常增殖，在腫瘤的發生中起重要作用。Verma 等利用RNAi 技術使這兩個基因表達降低，在細胞和裸鼠中都能抑制腫瘤細胞的增殖。以erbB1、端粒酶為靶點，利用RNAi技術抑制腫瘤的研究也取得了滿意結果。 問題與展望 目前，RNAi 在非脊椎動物如線蟲、果蠅、以及植物中的應用已經取得了一些重要的成果，但在哺乳動物中的應用還處于起步階段。在哺乳動物細胞中，RNAi 并不能完全阻斷基因的表達，特別是表達異常高的基因；其次，RNAi并不適應所有的基因，如dsRNA 對一些在神經細胞中發揮功能的基因抑制作用不明顯；另外，運載體系一直是體內基因治療的瓶頸，如何將雙鏈RNA 高效特異的轉入體內仍是一個難題。目前已能用腺病毒作為載體在體內實現RNAi ，但仍需要尋找更為安全有效的載體。RNAi現象存在的廣泛性遠遠超過人們的預期，對此問題的深入研究將為進化的觀點提供有力佐證。不可否認，與其它幾種進行功能喪失或降低突變的技術相比，RNAi 技術具有明顯的優點，它比反義RNA 技術和同源共抑制更有效，更容易產生功能喪失或降低突變。而且通過與細胞特異性啟動子及可誘導系統結合使用，可以在發育的不同時期或不同器官中有選擇地進行，與T-DNA 技術造成的功能永久性缺失相比，它更受科學家偏愛。作者堅信隨著RNAi的深入研究，一個嶄新的RNA 時代即將到來。