A． 載體選擇 為了獲得能夠在體外轉錄RNA探針的DNA模板，其克隆載體必須帶有可供選擇的特異轉錄啟動子，同時，為了獲得理想的Northern雜交試驗結果，載體選擇帶有兩種不同類型而方向相反啟動子的載體，以便在RNA探針制備時同時得到兩條鏈的轉錄探針。 常用的這類載體有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ). pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ). PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ). Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ). 按照試驗的經濟有效原則，本試驗選用 Bluescript M13-。 B. 目的DNA序列與載體連接 從所建立的cDNA文庫中挑選出帶有目的DNA片斷的克隆，擴增后提取質粒，采用限制性內切酶處理或采用PCR特異擴增的方法分離出目的DNA片斷；采用標準質粒提取方法提取載體質粒（見黃健試驗）。然后按下列程序進行連接。 試劑及其制備 T4 DNA連接酶 連接緩沖液（可直接購買或配制），10X 緩沖液配方為： 0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8 0.1 mol/L MgCl2 50mmol/L 二硫蘇糖醇（DTT） ATP 5mmol/L ( 如果直接購買商品緩沖液，有的已加在緩沖液中，但有些需單獨加入)。 BSA 0.25mg/L PEG (3500~8000均可，在緩沖液中加入2%~3% 的PEG可提高平端連接效率)。 無菌蒸餾水（SDW） 試驗程序 1． 建立以下反應體系（終體積20μl）： 4μl 質粒 ( 50μg/μl) 6μl 目的DNA ( 100μg/μl) 2μl 10X 連接緩沖液 2μl DNA 連接酶 6μl 無菌蒸餾水 2． 反應管置于15℃條件下保溫反應24小時，65℃加熱10min.終止反應。 3．取5～10μl連接反應物用微型凝膠電泳檢測連接效果，其余反應物于-20℃保存備用。 注意事項 1．保證連接反應中目的DNA與質粒載體的濃度比例在3∶1，因為高濃度的DNA有利于片斷與載體的連接，低濃度的DNA則會增加載體自連。 2．DNA連接酶對溫度敏感，在15℃以上會迅速失活，因此，連接反應的溫度控制必須嚴格。 3．為了保證RNA探針的質量，模板DNA片斷的完整性和純度十分重要，在DNA制備時要嚴格控制。 C．感受態細胞制備（CaCl2法） 試劑及其配制 LB培養基（200ml）：2g胰蛋白凍、1g酵母浸膏、2g NaCl，溶解后調整pH至7～8，定溶到200ml混勻，分裝成50ml/瓶后滅菌4℃保存。 CaCl2 0.1mol/L，4℃保存。 E. coli菌株：JM105或TG1。 試驗程序 1．將單菌落菌株接種于5ml LB培養基中，在37℃條件下振蕩培養過夜。 2．取0.5ml過夜培養的菌液接種于50ml LB培養基中，在37℃條件下振蕩培養約3小時，用分光光度計檢測OD600＝0.3～0.4時，取出培養瓶置于冰上完全冷卻。 3．將菌液轉入離心管中，在4℃條件下，3500rpm離心5～10min.，棄去上清液。 4．將沉淀懸浮于預冷的25ml 0.1mol CaCl2中，在冰上放置30min.后，于4℃條件下，3500rpm離心5～10min.，棄去上清液。 5．沉淀重懸于2ml 預冷0.1mol CaCl2溶液中，菌液直接用于轉化。或加入1.6ml 80%甘油，按每管200μl分裝于2ml的凍存管中，于液氮中速凍后-70℃保存備用。 D. 質粒DNA轉化 試劑及其配制 LB培養基（同C）。 氨芐青霉素：用無菌蒸餾水配制成50mg/ml的貯存液。 含氨芐青霉素（AP）的LB平板：每升LB培養基中加入15g瓊脂，溶化后高壓滅菌，待稍涼后再加入氨芐青霉素至終濃度為50~100μg/ml。在超凈工作臺上用9cm滅菌培養皿鋪板。 IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside 異丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：取2g溶于8ml雙蒸水中，定容至10ml，過濾滅菌后-20℃保存。 X ? Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：貯存液濃度為20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃黑暗保存。 試驗程序 1．取制備分裝好的感受態細胞，置于冰上5min.，加入連接產物10μl，輕輕混勻后置于冰上30min.。 2．然后置于42℃水浴中熱擊細胞50s.，再置于冰上2min.。 3．向各管中加入200μl在37℃下預熱的LB培養基，37℃下振蕩培養1小時。 4．與此同時，將LB平板置于37℃下片刻，每板加入44μl IPTG/X-Gal (4μl IPTG和40μl X-Gal )均勻涂布于平板表面放置約10min.使其吸附滲透。 5．將步驟3中培養的菌液涂布在制好的平板上，吹干后（在超凈工作臺中放置片刻）置于37℃下培養過夜。含有插入片斷的菌落為白色。 E. 轉化質粒的快速檢測 試劑及其配制 煮沸緩沖液：蔗糖 8％ Triton X-100 1.5% EDTA(pH 8.0) 50mmol/L Tris-HCl(pH 8.0) 10mmol/L LB培養基（同C） 氨芐青霉素（AP）（同D） 試驗程序 1．選取白色單菌落，接種到3ml含AP的LB液體培養基中，37℃下振蕩培養過夜。 2．將培養物等分成2份按菌落編號，每一菌落編號切勿出錯。一份于4℃下保存備用，每一菌落編號切勿出錯。另一份轉入Eppendorf中，7000rmp離心2min.，棄去上清液，吸干殘留液體。 3．將沉淀菌體細胞懸浮于350μl煮沸緩沖液中，加入25μl溶菌酶后，渦旋混合。 4．將管置于100℃沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp條件下離心15min.。 5．取10μl上清液，加入溴酚藍染料后，在0.8%瓊脂糖膠上電泳。 6．在紫外燈下根據分子量檢測插入片斷的完整性。 如果不能確定轉化片斷的大小，則要進一步雜交、測序分析。選取經檢測含有完整目的DNA片斷的菌落，轉接于2ml TB培養基（每升16g胰化蛋白凍/10g酵母提取物/5g氯化鈉）中，37℃下振蕩培養過夜，取850μl菌液加入到一2ml的凍存管中，再加入150μl 50%的甘油，混勻后置于液氮中快速冷凍，再置于-70℃條件下保存。