?

1.Total?RNA?isolation： 測定OD260 ，OD280 及兩者比值，換算出RNA的濃度。并電泳鑒定。 2.Gel： 以80ml的1.5％甲醛瓊脂糖凝膠為例： agrose：1.2g dd?H2 O：57.6ml 10×RNB*(RNA?buffer)：8ml（RNB具體配方見后，用*表示，下同） 甲醛溶液：14.4ml 3.?Electrophoresis： （1）加樣：（以取20μg?RNA為例）在0.5ml管中加20?μg?RNA＋2－4倍RNA體積的SB溶液*?，votex，65℃熱變性10min，立即上冰5min，微離心一下，加相應的10×loading?buffer（大連寶生物公司taq酶系列會提供），混勻，準備上樣。 （2）預電泳：在正式上樣電泳前，在膠點樣孔中各加一點10×loading?buffer（加的孔數要超過正式電泳所用的點樣孔）先看點樣孔漏不漏，預電泳15－20min。此工作可在RNA變性時進行。這一方面可判斷膠漏不漏，另一方面可使膠活化。 （3）正式電泳：將（1）步的混勻樣全部加入點樣孔，50V電泳4－5小時（電泳時間長短還要依你膠的大小而定，一般要使loading?buffer跑到四分之三左右。 電泳最好在4℃冰箱里進行，并且要有循環器在電泳緩沖液兩邊進行交換，以防兩端緩沖液PH相差過大。電泳緩沖液用1×RNB。 4.轉膜： （1）在轉移槽內放好玻璃板，鋪好濾紙橋，緊貼玻板。 （2）倒入轉移液（20×SSC*），浸透濾紙橋，驅除氣泡，同時按膠大小剪好合適的膜（膜為Amersham公司的Hybond－N＋膜）和兩張同樣大小的濾紙。 （3）將膠從加樣孔先接觸濾橋面，自一端將膠滑放至濾紙橋上，注意不留氣泡。 （4）將膜放在膠上，小心慢速，自一端起緊貼膠面，檢查及排除氣泡，用一干凈玻棒輕緩的在膜上滾幾下以排除氣泡。 （5）用保鮮膜在四周封邊，在尼龍膜上放上兩張濾紙片，再堆上5－8cm吸水紙堆，壓上重物，10－24hr。 （6）轉膜完畢，移去吸水紙，將膜取出，紫外交聯（245nm1.5J/cm2照射膜1min45s）并標好膜的正面及加樣順序，將膜在6×SSC或2×SSC溶液中浸泡一下，純水沖洗一下。 （7）用亞甲基藍溶液浸泡搖晃染色3－5min，純水搖床脫色，可見RNA電泳條帶，標好28S，18S。 5.探針的標記：（下列物質除α-32 P?dATP購自Amersham公司，其余來自于Promega公司的labeling?kit） （1）?取25－40ng的模板DNA（假設以1μL為例）于0.5ml管中，加11μL?dd?H2 O,100℃變性5－10min，立即上冰5min。 （2）?在冰上依次在管中加入：? ?????????????????????????????BSA:?1μL ?????????????????????????????dNTP(-dATP):1μL?? ?????????????????????????????labeling?5×buffer:?5μL ?????????????????????????????klenow酶：1μL（5U/μL） ?????????????????????????????α-32 P?dATP(最后加)?5μL ???????????????????????????????????（合計：25μL體系） 振蕩后放入鉛盒，37℃?1hr，加200μL?dd?H2 O終止反應。可4℃短暫保存。 6.探針的純化（sephades?G－50柱層析法）： ???（1）1ml注射器底部用無菌玻璃棉填塞，加剪蓋的0.5ml管放入體積較大的離心管中，注射器中裝填用ＳＴＥ平衡的sephades?G－50凝膠。 ???（2）層析柱室溫離心，1000g×2min，再重復步驟（1）（2），使注射器裝滿sephades?G－50凝膠。 ???（3）將標記好的探針滴加在層析柱上，離心，1000g×4min，收集0.5ml管中液體，即為純化好的標記cDNA探針。

7.?雜交： ????（1）將膜反面緊貼雜交瓶，加入雜交液5ml左右，42℃預雜交?1－3hr。 ????（2）換新雜交液2ml（雜交液體積應根據雜交瓶大小而定，必須使瓶平放時，雜交液鋪滿底部）將變性的探針（95－100℃10min，上冰5min）加入雜交液中，合適溫度下雜交16hr左右。 8.?洗膜： 雜交完畢，傾去雜交液，用洗膜液*洗膜2－3次，一次1hr左右。 9.?壓片： ??????用滅菌清水漂洗，保鮮膜包好膜，避免氣泡，置于暗盒，固定好，壓上柯達X光片，－80℃放射自顯影。（具體時間依monitor檢測的強度而定）。 10.?沖洗照片，分析結果。 11.?煮膜：（用于洗去雜上的探針，以備后用） ???????在燒杯中加入煮膜液*，將膜放入其中，最好反面緊貼燒杯壁，燒杯放在電爐或煤氣爐上煮沸30－45min左右，清水漂洗后，用monitor檢測有無信號，若還有，繼續換煮膜液再煮一次，煮后最好壓一張新片，以判斷背景。? ? 附：常用配方： 雜交液???0.2M?PBS(PH7.2)→→?200ml?1M?PBS(PH7.2)? ??????????????1mM?EDTA(PH8.0)?→→?2ml?0.5M?EDTA(PH8.0) ??????????????1%?BSA?????????→→??10g?BSA（最后加，不可加熱和劇烈攪拌） ??????????????7%?SDS?????????→→??70g?固體SDS? ??????????????15%?formamide??→→??150ml?甲酰胺 ??????????????dd?H2 O?補至?1000ml ???(1M?PBS=57.7ml?1M?Na2 HPO4 +42.3ml?1M?NaH2 PO4 ) 無需高壓滅菌。（下同）但需裝于棕色瓶中。

洗膜液????????40mM?PBS(PH7.2)→→?40ml?1M?PBS(PH7.2) ??????????????????1mM?EDTA(PH8.0)?→→?2ml?0.5M?EDTA(PH8.0) ??????????????????1%?SDS?????????→→??10g?固體SDS ??????????????????dd?H2O?補至1000ml? ? 煮膜液?????????1mM?EDTA(PH8.0)?→→?2ml?0.5M?EDTA(PH8.0) ???????????????????????10mM?Tris???????→→??1.211g?Tris堿 ????????????????????????1%?SDS?????????→→??10g?固體SDS? ??dd?H2 O補至1000ml

?