1、RNase 是RNA制備的殺手 RNase酶非常穩定，是導致RNA降解最主要的物質。它在一些極端的條件可以暫時失活，但限制因素去除后有迅速復性。用常規的高溫高壓蒸氣滅菌方法和蛋白抑制劑都不能是RNase完全失活。它廣泛存在于人的皮膚上，因此，在與RNA制備有關的分子生物學實驗時，必須戴手套。RNase的又一污染源是取液器。根據取液器制造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內部和外部，基本達到要求。取RNase-free的物品時必須戴手套。 ? 2、塑料制品、玻璃和金屬物品的處理 (a)塑料制品：盡可能使用無菌，一次性塑料制品。已標明RNase-Free 的塑料制品，如沒有開封使用過，通常沒有必要再次處理。對于國產塑料制品，原則上都必須處理方可使用。處理方法如下： (1)在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使DEPC的終濃度為0.1%。注意：DEPC為劇毒物，活性很強，小心在通風柜中使用。 (2)將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 (3)在通風柜中室溫處理過夜。 (4)將DEPC水溶液小心倒到廢液瓶中，用鋁箔封住含已DEPC水處理過的塑料制品的燒杯，高溫高壓蒸氣滅菌至少30分鐘。 (5)烘箱用合適的溫度烘拷至干燥。置于干凈處備用。 (b)玻璃和金屬物品 250°C烘烤3小時以上。 ? 3、采用什么方式純化總RNA？ 答：我們提供多種RNA純化方式，根據您對RNA純化技術的熟悉程度，選用不同的純化手段。從產品使用效果看，基于TriBlue的一步法分離總RNA 試劑 盒（K311,K321系列）無論是新手還熟手都可以得到比較理想的結果。如果您對苯酚過敏，出于對環境的保護，您可以選用整個分離流程都不使用苯酚的 試劑 盒（K361系列）。從產品形式上，我們的總RNA分離分醇沉淀離心式和離心吸附柱方式兩種。沉淀方式總的產量比較高，純化規模機動，但是純度不及吸附柱方式；吸附柱方式操作比較簡單，純度高，受吸附容量的影響，產量收到影響。 ? 4、什么時候需要分離mRNA? 答：常規RT-PCR鑒定基因表達水平的，一般都可以采用總RNA作為RT-PCR 的模板，但是做cDNA文庫，克隆豐度極低的基因，大多數DD-PCR， 削減雜交等需要純化的mRNA。一般用oligo (dT)-cellulose或在磁珠上偶連oligo (dT)，從組織或總RNA種直接分離mRNA。 ? 5、如何判定分離的總RNA的純度？ 答：需要從兩個方面著手，缺一不可，特別是新手（1）測定OD260/OD280的比值，測定時，RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀釋。理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之間。比值如果過低，可能有蛋白質污染，過高RNA可能已發生降解。（2） 瓊脂 糖變性電泳觀察rRNA的完整性和強度。變性電泳需要采用 MOPS 系統，不可以采用DNA 電泳用的TBE或TAE系統。如果OD260/OD280過低（<1.7），通常可以通過減少組織和細胞的用量來實現。 ? 6、什么時候需要加入RNA-Carrier? 答：樣品很少或樣品中RNA含量低，制備RNA時需要加入一定的 RNA載體，以提高RNA純化的得率。常用的載體有PolyAcryl Carrier, Poly A, Poly C和Glycogen。一定濃度范圍的 Carrier對一些RNA的下游應用沒有影響，如RT-PCR, Northern Blot。 ? ? 7、如何除去純化的RNA中微量的基因組DNA? 答：無論用種方式制備的總RNA,要絕對保證不含基因組DNA是不現實的。如果您希望得到DNA free 的RNA樣品，需要用RNase free的DNase I處理。 ? 8、純化的RNA樣品如何保存？ 答：如果希望得到最佳的結果，純化的RNA需要立即用于下游實驗。RNA可以保存在-80C冰箱，長期保存可以置于液氮中。如果沒有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在異丙醇或乙醇中，-20度保存。 ? 9、組織和細胞樣品如何收集，保存？ 答：組織樣品收集后，需要立即保存在液氮中，或在樣品中加入一定量的保護劑，有一些商業化的產品可以選用。一般實驗收集50-100mg組織就足夠了。 ? 10、如何估計RNA的產量？ 答：能計算出RNA的產量，通常都是有比較多的起材料，但是很多情況下能夠取得材料很少，所制備得到的RNA無法通過分光光度的方法測定含量和濃度。RNA的含量與組織和細胞的類型有比較大的關系, 同時與抽提的方式有關，例如用抽提小鼠組織100mg 肝可以得到500ug總RNA, 100mg肺 得到200ug總RNA, 1百萬個細胞Hela細胞可以得到15ug左右的總RNA. mRNA的含量一般占總RNA含量的2-5%。根據這樣一些經驗值，估算出您可能得到的量。樣品如果低于20mg或10000個細胞，在抽提時需要考慮加入合適的RNA沉淀載體。 ? 11、RNA制備過程中那個環節要特別注意？ 答：一般情況下，細胞和組織在RNA抽提液中都可以保存一段時間，因為幾乎所有的RNA的抽提裂解液中都含有高濃度的異硫氰酸胍等強變性劑, RNase基本是不起作用的，操作即使是粗放一些，也沒有多達關系。但是通常是離心后取上清，這時候RNA已沒有保護，操作要特別小心。