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  • 實驗方法> RNA實驗技術> RNA原位雜交>原位雜交檢測

    原位雜交檢測

    關鍵詞: 來源: 上海歌凡生物科技有限公司

    原位雜交實驗流程 常規脫蠟至水洗。 制作濕盒:用5×SSC(35ml)+甲酰胺(35ml)置于濕盒內。 30%H2O21份+9份純甲醇混合液室溫處理10min。DEPC水洗3次,每次1min; 切片置于濕盒內,用0.2mol/L鹽酸滴于組織上,常溫15min,用DEPC水洗2次,每次1min(鹽酸可中和帶電荷的堿性蛋白,降低背景) 蛋白酶K覆蓋組織,分子雜交儀中37℃20min。蛋白酶K可以消化和暴露被遮蔽的靶核酸,增加探針的結合效率。 用0.2%或0.1mol/L甘氨酸洗液洗1min(現用現配),終止蛋白酶K。 PBS洗兩次,每次一分鐘。 用4%PFA多聚甲醛固定組織10min。 PBS洗三次,每次1min。 用acetic anhydride乙酸酐ph=8.0(乙酰化作用,降低背景)室溫洗5min,2次.用PBS洗5次,每次1min。 用5×SSCph7.5洗兩次,每次1min。 切片放置濕盒內,用預雜交液 覆蓋組織,65℃預雜交 1h。 500ng/ml FAM -labeled pube 探針覆蓋切片,在雜交儀內65℃黑暗反應48h,。 用2×SSC ph=7.5,室溫洗1次,1min。 用甲酰胺 加4×SSC ph=4.5 1:1混合液在60℃或65℃洗三次,每次20min。 用PBS洗5次,每次1min,室溫。 用DEPC處理水500倍稀釋DAPI,染核5min。 用PBS洗3遍,每遍5min. 滴加防淬滅劑,蓋蓋玻片。指甲油封片,熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察

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