一、材料 水稻葉片或小鼠肝組織。 二、設備 研缽，冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。 三、試劑 ? 1. ?無RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小時）裝蒸餾水，然后加入0.01%的DEPC（體積/體積），處理過夜后高壓滅菌。 ? 2. ?75%乙醇：用DEPC處理水配制75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。 ? 3. ?1×層析柱加樣緩沖液；20 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.1% SDS。 ? 4. ?洗脫緩沖液：10 mmol/L Tris-HCl（pH7.6），1 mmol/L EDTA（pH8.0），0.05% SDS。 四、操作步驟 ? （一）動植物總RNA提取-Trizol法 Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。 ? 1. ?將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100 mg組織加入1 ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用Trizol體積的10%。 ? 2. ?研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1 mlTrizol液加入0.2 ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 ? 3. ?取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000 g離心10分鐘。 ? 4. ?棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1 ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4 ℃下7500 g離心5分鐘。 ? 5. ?小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時可55 ℃-60 ℃水溶 10分鐘。RNA可進行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70 ℃。 [注意] 1. ?整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。 ? 2. ?加氯仿前的勻漿液可在-70 ℃保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4 ℃保存一周，-20 ℃保存一年。 ? （二）mRNA提取 由于mRNA末端含有多poly(A)+，當總RNA流徑oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異的吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的mRNA。 ? 1. ?用0.1 mol/L NaOH懸浮0.5-1.0 g oligo(dT)纖維素。 ? 2. ?將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經DEPC處理并經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0 ml，用3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。 ? 3. ?用1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。 ? 4. ?將（一）中提取的RNA液于65 ℃溫育5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有RNA溶液進入柱床后，加入1倍柱床體積的1x層析柱加樣溶液。 ? 5. ?測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時，加入2-3倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液，以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。 ? 6. ?測定OD260，合并含有RNA的洗脫組分。 ? 7. ?加入1/10體積的3 M NaAc(pH5.2)， 2.5倍體積的冰冷乙醇， 混勻， -20 ℃30分鐘。 ? 8. ?4 ℃下12000 g離心15分鐘，小心棄去上清液，用70%乙醇洗 滌沉淀，4 ℃下12000 g離心5分鐘。 ? 9. ?小心棄去上清液，沉淀空氣干燥10分鐘，或真空干燥10分鐘。 ? 10. ?用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并貯存于-70 ℃）。 [注意] 1. ?mRNA在70%乙醇中-70 ℃可保存一年以上。 ? 2. ?oligo(dT)纖維素柱用后可用0.3 mol/l NaOH洗凈，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。