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    RNA干擾技術在哺乳動物中的應用

    關鍵詞: rna 干擾 技術來源: 互聯網

    陳 杰 白春學 張 敏(復旦大學附屬中山醫院肺科, 上海200032)

    摘要 RNA 干擾(RNAi) 是生物界普遍存在的一種抵御外來基因和病毒感染的進化保守機制. RNAi 是由雙鏈RNA 觸發的轉錄后基因沉默機制, 具有序列特異性, 在哺乳動物細胞中, RNAi 由21~23 個核苷酸組成的雙鏈RNA 引發. 小干擾RNA (siRNA) 可以在體外合成或通過表達載體在哺乳動物細胞內合成. 由于RNAi 技術具有快速、簡單和特異性強等特點, 在基因功能研究、抗病毒治療和抗腫瘤治療等方面有廣泛的應用前景.

    關鍵詞 RNA 干擾, 小干擾RNA , 哺乳動物

    RNA 干擾( RNAi) 是由雙鏈RNA ( double strands RNA , dsRNA) 引起的, 廣泛存在于動物植物中的序列特異性轉錄后基因沉默過程, 是生物體在進化過程中, 抵御病毒感染及由于重復序列和突變引起基因組不穩定性的保護機制. Elbashir等[1 ]發現, 一種稱為短干擾或小干擾RNA ( small interfering RNA , siRNA) 的RNA 干擾中間體,能在果蠅中導致mRNA 的降解.這種iRNA 為21個核苷酸, 形成19 bp 的雙鏈RNA 分子, 3&prime;端有2個核苷酸突出(overhang) , 可激活哺乳動物細胞的RNAi 機制.

    1 RNAi 的機制

    RNAi 在哺乳動物中的機制基本上與果蠅和其他低等生物中RNAi 的機制相似 [2 ,3 ] . 基本步驟由啟動和效應步驟構成 [4 ] , 啟動步驟為較長的雙鏈RNA 經過RNA 酶Ⅲ核酸酶(Dicer) 處理后, 降解成21~23 個堿基的siRNA , siRNA與靶mRNA有高度的序列特異性. siRNA 在3&prime;端有2個堿基突出. 效應步驟為siRNA與RNA 酶結合形成一個RNA誘導沉默復合體( RNA-induced silencing complex , RISC) , RISC 是分子質量為50 ku 的內源性核酸酶, 并與siRNA 序列互補的內源性mRNA結合, 核酸酶在siRNA2mRNA 結合體3&prime;端大約12個堿基處切割mRNA , 使之喪失轉錄信息, 達到特異性抑制目的基因表達效果.

    2 RNAi 在哺乳動物細胞中的應用

    2 . 1 體外合成 siRNA

    如何實現哺乳動物細胞中RNAi , 目前使用得最多最廣泛的是siRNA 雙鏈復合體(depluxes) .siRNA 雙鏈復合體是根據靶mRNA 序列設計的21個核苷酸的雙鏈, 由一條正義鏈和反義鏈組成, 其中正義鏈19 個核苷酸序列與靶序列相同, 3&prime;端有2個堿基突出, 一般為UU 或dTdT , 反義鏈19 個核苷酸序列與正義鏈互補, 3&prime;端也有2 個堿基突出, 一般為dTdT 或UU , 3&prime;端dTdT 結構對siRNA 雙鏈復合體的穩定性有很大貢獻, 而3&prime;端UU結構有利于siRNA 介導的基因沉默. 研究哺乳動物RNAi 機制的學者建議, 最有效的雙鏈siRNA 序列應該是與靶mRNA 序列互補的19 個核苷酸序列, 外加3&prime;端2 個堿基突出構成21個堿基的雙鏈RNA , 研究表明[3 ] siRNA 雙鏈的反義鏈具有識別靶點基因序列的功能, 而正義鏈沒有序列識別功能. 在設計雙鏈siRNA 時, 通常將mRNA 開放閱讀框區域作為作用靶點, 從啟動子下游50~100 個核苷酸開始搜尋理想的靶序列. 為了避免mRNA 調控蛋白的影響, 3&prime;端和5&prime;端非翻譯區域或者啟動子不應該作為作用靶點. Tuschl 等在化學合成21~23 nt siRNA 方面的研究取得了很好的成績 [5 ] .目前已經有多家公司可以提供siRNA 化學合成服務, 比較著名的有Dharmacon (www. dharmacon.com) 、Qiagen ( www. giagen. com) 、Proligo ( www.proligo. com) 和Ambion (www. ambion. com) 等. 廠家可進行siRNA 序列設計和合成, 他們采用(AA2N19) 標準進行siRNA 設計, 即19nt + dTdT或UU , 19nt 序列基礎上在3&prime;端加2 個堿基(圖1) . 研究者也可以根據自己的需要進行設計,RNA 最大合成堿基數量為80 nt , 為了防止siRNA的降解, siRNA 通常采用了堿基保護措施, 使用前根據 試劑 盒提供的緩沖液和步驟去保護. 采用2&prime;2ACE 技術保護的合成RNA 凍干粉, 在- 20 ℃可以保存1 年. 另外, siRNA 的保存時間與siRNA自身序列、所采用的保護方法、保存溫度等因素有關. 2p-OH 形式的RNA 可以保存6 個月. 研究表明, 以AA-N19 標準設計的siRNA , 在哺乳動物細胞中70 %~80 %有RNAi 作用.

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