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改善RNA提取的4點建議
關鍵詞： 改善 rna 提取 建議來源： 互聯網
| 在分離RNA時，良好的實驗室技術很關鍵。與DNA相比，RNA更加嬌貴，也更不穩定。RNA含有高反應性的羥基（C-OH）基團，確保鏈不斷合成、分解和再次利用。分離出的RNA迅速降解，并很容易受到核糖核酸酶（RNase）的污染。RNase似乎隨處可見。 加利福尼亞州科學院（California Academy of Sciences）的Jack Dumbacher博士目前正開展轉錄組和小RNA的分離，以便鑒定宏基因組病毒序列。他的研究目標是了解病毒與宿主的共生關系。Dumbacher博士為改善RNA提取提出了幾點建議。 優化RNA的保存 研究小組常常從偏遠地區采集樣本，如熱帶雨林或珊瑚礁。他們的最大挑戰在于無法用液氮迅速冷凍樣本，而RNA在乙醇中逐步降解。于是，他們用拭子蘸取鳥的泄殖腔，并放在RNA穩定劑或其他包含4M 硫氰酸胍（GITC）的溶液中。由于鹽的濃度，一些RNA穩定劑可能會給RNA的分離造成困難。當然，如果能解決冷藏問題，保存RNA的最好辦法是采集后立即用液氮冷凍樣本，并保存在-80°C。 確保良好的分離 GITC溶液通常用于RNA提取中細胞和病毒顆粒的裂解，同時防止RNase的酶活。在這種情況下，研究小組必須在裂解之前進行完整病毒的分離，以便與細胞分開。在現場，他們用0.2 μm的過濾器來過濾較小的病毒顆粒。而較大的顆粒（如完整細胞）則被留下。其他實驗室若使用冷凍的組織樣本，則必須快速徹底地勻漿。無論選擇哪種方法，始終會有些基因組（gDNA）存在。具體有多少則在很大程度上取決于用戶的經驗和技術。 盡量避免RNase 在實驗室中，避免已純化的RNA接觸到內源和外源的RNase至關重要。在純化開始時，外源RNase不怎么成為威脅。但在沒有了變性劑（如GITC）的保護以及RNA純化完成后，你就要避免接觸RNase。RNase抑制劑隔離殘留的RNase，適合大部分應用，特別是那些包含內源RNase的應用。科學院的比較基因組實驗室使用經DEPC處理的水。DEPC通過堿基的組氨酸修飾而讓RNase失活。同時記住，及時更換手套。 提高RNA的產量 不同組織不同樣本的RNA產量會相差很大。對于Dumbacher博士而言，每個樣本的RNA量都很低。他們所獲得的RNA量取決于小鳥最后一次進食的時間，吃了什么。Dumbacher小組的下游應用是新一代測序。他認為，即使樣品的RNA含量很低，但在構建文庫以及獲得最終結果時還是會覺得不錯。 若要提高組織樣本的RNA產量，避免過度勻漿或加熱。勻漿30秒，再休息30秒，可改善RNA的回收。同時，用更多的水洗脫可釋放更多RNA。無論您的實驗室采用何種下游技術，成功的分析都取決于良好的RNA分離技術。孰能生巧，多試試一定行。? (責任編輯：大漢昆侖王) |
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