摘要 棉花組織富含多糖、棉酚等次生代謝物質, 較難提取高質量的RNA。本研究在前人方法的基礎上對快速提取棉花組織總RNA 的方法進行了探討。利用改進的CTAB 異硫氰酸胍裂解緩沖液, 獲得的RNA完整性好, 無DNA 污染, 含量高, 每克鮮組織能提取015mg 總RNA , OD260/ OD280比值均在117～210之間。該方法不但適用于葉片提取總RNA , 而且在根、花冠、種子、發育的纖維中均能提取出高質量的RNA , 同時節約成本, 相對于試劑盒提取RNA , 成本大為降低。

關鍵詞 棉花組織, RNA , 提取

A Method of Total RNA Isolation in Cotton Tissues Wen Xiaojie 　Zhang Guiyin 　Wang Xingfen 　Li Xihuan 　Ma Zhiying

Agricultural University of Hebei , Baoding , 071001 Corresponding author , mzhy @mail1hebau1edu1cn

ABSTRACT The cotton tissues contain a lot of secondary metabolites such as phenolics , polysaccharides etc , thereforef rom which it is difficult to isolate high quality RNA.According to the prior research , a highly efficient ext raction method was modified1 High2concent ration and DNA2f ree RNA could be attained by using CTAB/ Guanidine Thiocyanate ext racion buffer1The total RNA can reach 1.7～2.0 of the OD260/ OD280 ratio with the yield of more than 015mg per gram of f resh tissues1 The method is suitable for high2quailty total RNA ext raction in leaves , root s , corollas , seeds and developing fibers. And the cost of this method is much lower compared with that using the commercicol kit of RNA ext raction.

KEYWORDS Cotton tissues , RNA , Isolation

棉花組織RNA 的提取是進行棉花分子生物學研究的必要前提。進行Northern 雜交分析、體外翻譯、建立cDNA 文庫、RT2PCR 及差異顯示分析等研究都需要高質量的RNA (李宏和王新力,1999 ; 趙雙宜等, 2002) 。棉花組織中富含多糖、多酚等次生代謝物質, 在提取過程中, 多糖易與分子植物育種,2004 年,第2 卷,第1 期,第147 —150 頁Molecular Plant Breeding ,2004 ,Vol12 ,No11 ,147 —150 　RNA 共沉淀, 多酚類物質極易被氧化成紅褐色物質, 然后與核酸不可逆的結合, 對RNA 的提取造成干擾。RNA 極易受到RNA 酶的影響而降解以及受到蛋白質、DNA 等的污染而降低RNA 的質量(Woodhead et al1 , 1997 ; Maliyakal , 1992 ) 。目前用于RNA 提取的試劑盒雖然操作簡便、能快速提取植物組織RNA , 但其價格昂貴, 提取成本較高。本試驗針對一些主要影響因素, 對快速簡便提取棉花組織RNA 的方法進行了探索。

1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 供試材料: 棉花品種為河北農業大學棉花育種研究室培育的“農大94 - 7”, 試驗所用葉片、根、纖維、花冠、種子均取自新鮮組織。 1.1.2 試驗藥品: 異硫氰酸胍( Guanidine Thio-cyanate) 、丙烷磺酸(Moropholino ethanesulfonic acid ,MOPS) 、焦碳酸乙酯(Diethyl Pyrocarbonate , DEPC) 、β- 巰基乙醇(β- Mercaptoethanol) 購自Amresco 公司, 溴代十六烷基三甲烷(Cetyltrimethyl Ammonium Bromide , CTAB) 、聚乙烯吡咯烷酮(PolywinyPyrro-lidone40 , PVP40) 、三羥基甲烷( TRIS) 、乙二胺四乙酸(Ethylenediamine teraacetic acid , EDTA) 等均購自Sigma 公司, 為超純進口試劑, 其它試劑為一般分析純化學試劑。 1.2 方法 1.2.1 試劑配制: RNA 提取緩沖液: 4Mol·L - 1異硫氰酸胍, 0.1Mol·L - 1 Tris 堿(pH815) , 114 Mol·L - 1NaCl , 0.02Mol·L - 1 EDTA , 2 %CTAB , 2 %PVP40 , 1 %β- 巰基乙醇。 MOPs 緩沖液( 10 ×) : 0.4 Mol ·L - 1 MOPs(pH710) , 0.1 Mol·L - 1NaAc , 0.1 Mol·L - 1EDTA 。上樣染料: 50 %甘油, 1 Mol ·L - 1 EDTA ,0.4 %溴酚藍, 0.4 %二甲苯青。 其它試劑: 均需用DEPC 處理過的水配制,經高溫滅菌待用, 或為新開封專門用于提取RNA的試劑。所用試劑瓶、電泳槽也需是無RNA 酶污染的, 一次性使用的塑料制品如槍頭、離心管等可經高溫滅菌后直接使用。 1.2.2 提取步驟 取1g 左右的棉花新鮮組織加入液氮迅速研磨成均勻的粉末, 轉入10mL 離心管中, 加入3mL預冷的RNA 提取緩沖液混勻, 置于冰上; 每管依次加入3 Mol·L - 1 NaAc200μL , 酸酚3mL , 氯仿:異戊醇600μL ( 每加一種試劑都要輕搖混合均勻) , 冰浴15min ; 4 ℃條件下, 5 300rpm 離心30min , 吸上清于另一離心管中, 加入等體積氯仿: 異戊醇混勻; 4 ℃條件下, 5 300rpm 離心20min , 吸上清加入等體積的異丙醇混勻后置于-20 ℃冰箱冷凍1h 以上; 4 ℃條件下, 5 300rpm 離心30min , 去上清, 用70 %乙醇清洗2～3 次, 并轉入115mL 離心管中, 干燥后溶于適量DEPC 水中, 取1μL 進行檢測, 其余- 70 ℃冰箱中保存。

1.2.3 檢測方法 1.2.3.1 變性瓊脂糖凝膠電泳(王關林和方宏筠,1998) a 凝膠制備: 稱取0125g 瓊脂糖, 加入20mL 蒸餾水, 微波爐加熱溶解, 待膠涼至60～70 ℃, 依次加入4.5mL 甲醛, 2.5mLMOPs 緩沖液(10 ×) 和0.2μL 溴化乙錠, 混合均勻, 灌制瓊脂糖凝膠。 b 樣品準備: 取0.5mL 小離心管, 依次加入試劑: MOPs 緩沖液(10 ×) 2μL , 甲醛3.5μL ,甲酰胺10μl , RNA 樣品4.5μL , 混勻, 將離心管置于65 ℃水浴中保溫10min , 再置冰上2min , 向管中加入3μL 上樣染料, 混勻點樣。 c 電泳條件: 1 ×MOPs 緩沖液, 電壓120V ,時間15min。 1.2.3.2 非變性瓊脂糖凝膠電泳: 111 %瓊脂糖凝膠, 015 ×TBE 緩沖液, 120V , 電泳15min。

2 結果分析 2.1RNA 質量分析 總RNA 的完整性對cDNA 的合成及PCR 過程有很大影響, 本方法從棉花組織中提取的總RNA , 無論是變性還是非變性瓊脂糖凝膠電泳,都可以檢測到28s、18s、5s rRNA 三條帶, 且28srRNA 的條帶較亮, 亮度基本為18s rRNA 的兩倍(圖1) , 沒有拖帶現象, 表明所提取的RNA 樣品較為完整, 基本無降解, 可直接用于cDNA 合成 (圖2) , 進行cDNA - AFL P 分析(圖3) 。

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2.2 RNA 純度及產率 所取的棉花組織總RNA 稀釋后經BECKMAN DU800 紫外分光光度計檢測, 所有樣品OD260/ OD280均在118～210 之間, 表明酚類物質和蛋白 質等雜質少, 該方法所提取的RNA 樣品純度較 好, 同時, 測得幼葉RNA 濃度大約650ng·μL - 1 , 濃度較高。(表1)

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3 討論 近年來, 對RNA 提取方法已有許多報道, 但適合棉花RNA 提取的方法并不多, 而且存在著費用高,操作時間長等弊端。本試驗針對提取的主要影響因素進行摸索, 建立了一個簡單快速提取棉花組織RNA的方法。棉花組織富含棉酚、多糖等次生代謝物質,為其RNA 提取帶來困難。酚類物質會隨著植物的生長而增加, 因此本試驗所用材料均為幼嫩新鮮組織。由于酚類物質極易被氧化為褐色物質進而與RNA 穩定結合, 影響RNA 的分離純化。β- 巰基乙醇能防止酚類物質的氧化, PVP40 中的CO - N = 有很強的結合酚類化合物的能力, 與其形成穩定的復合物, 使之在以后的抽提步驟中被除去(李宏和王新力, 1999) 。緩沖液中同時使用還原劑β- 巰基乙醇和螯合劑 PVP40 , 有效的降低了酚類物質的影響。多糖是RNA提取中的又一主要障礙, 多糖的許多理化性質與RNA 相似, 很難將它們分開, 在沉淀RNA 時很容易產生多糖的膠狀沉淀, 難溶于水, 同時多糖可抑制許多酶的活性, 為RNA 樣品的進一步分子生物學研究帶來困難。本試驗通過提高鹽離子濃度(王文鋒等,2002) , 酚、氯仿: 異戊醇進行抽提去除多糖, 緩沖液中加入高濃度的NaCl , 抽提前又加入3M的NaAc ,增加了Na 濃度, 減少了多糖的干擾。另外, 提取緩沖液中利用CTAB 和異硫氰酸胍相結合, CTAB 是一種較強的去污劑, 對蛋白的變性效果明顯強于SDS。如圖1 所示: 1、2 泳道為CTAB 法提取的RNA , 3、4 泳道為SDS 法所提取; 異硫氰酸胍是一種強烈變性劑, 與CTAB 共同作用能迅速溶解蛋白, 導致細胞結構破碎, 在β- 巰基乙醇及PVP40 的作用下還可抑制棉酚對細胞器內脂肪、多糖及蛋白質的氧化作用(趙雙宜等, 2002 ; 徐亞濃等, 2002) 。與其它現有的棉花總RNA 提取方法相比, 直接用酸酚、氯仿:異戊醇一次抽提, 去除蛋白較徹底, 節省了操作步驟和時間, 由于棉花花冠、幼胚含蛋白較多, 可以用氯仿:異戊醇多次抽提直到分界面干凈; 同時利用酸酚抽提促使RNA 進入水相, 而DNA 留在有機相, 降低了DNA 的污染。用異丙醇沉淀RNA , 避免了LiCl 沉淀所需時間長(3h 以上) 的缺點。本試驗整個操作過程所需時間不足4h , 因此該方法能快速獲得RNA ,而且操作均在低溫條件下進行, 減少了RNA 降解的 可能性。另外, 在提取過程中, 一定要嚴格操作,Rnase 無處不在, 非常穩定, RNA 極易降解, 所需器皿、場地、藥品應為提取RNA 所專用, 并且用DE-PC處理之后高溫滅菌, 操作人員自身也要嚴格要求,操作過程中使用一次性手套, 而且需要經常更換, 盡量減少交談和人員流動, 以防止外源Rnase 污染。 經試驗該方法適合棉花各組織總RNA 的提取, 與已有的提取方法相比操作步驟簡單, 提取成本低, 能快速獲得高質量、高純度的RNA , 為進一步分子生物學研究奠定了基礎。