在人細胞中快速、高水平地表達目的蛋白 在2至3個星期內即可獲得高效價的病毒 無需噬斑純化 靶細胞可以是分裂或不分裂的細胞（dividing/or nondividing cell）

??? CLONTECH的Adeno-X?表達系統是一個特別 高效的腺病毒表達系統，用于在人細胞中瞬時及高水平地表達目的蛋白質。由于Adeno-X?病毒DNA中含有特別設計的克隆位點，你可以在2星期內獲得高效價的腺病毒，其效率遠高于其他腺病毒系統。 ??

高效表達目的蛋白質??? 腺病毒介導的基因轉移可以在人細胞中最高水平地表達目的蛋白質 (1)。因為含目的基因的重組腺病毒DNA是游離于細胞基因組外的 (不整合入宿主基因組)，所以目的蛋白質得到瞬時的高水平表達。更重要的是利用腺病毒表達系統可以將外源基因轉到分裂及不分裂的細胞中表達。

????下表比較了腺病毒和逆轉錄病毒系統的特點。這兩個表達系統是互補的，選擇適當的表達系統，就可以把目的基因轉入任何種類的人細胞。如果需要瞬時、高水平地表達蛋白質，那么腺病毒表達系統是最佳的選擇.?

腺病毒表達系統vs.逆轉錄病毒表達系統

腺病毒表達系統

逆轉錄病毒表達系統

病毒DNA游離于宿主基因組外，瞬時表達外源基因

病毒DNA整和于宿主基因組內，長時間、穩定表達外源基因

感染分裂和不分裂細胞

只感染有絲分裂細胞

高水平表達

中水平表達

雙載體

單載體

病毒滴度高達1012pfu/ml

病毒滴度最高可達106pfu/ml

可插入高達8kb的外源片段

可插入不超過6.5kb的外源片段

會引起體內免疫反應

不會引起體內免疫反應

構建重組腺病毒簡單快捷??? 構建重組腺病毒的兩種傳統方法是以同源重組為基礎的。其一是用修飾的腺病毒DNA與穿梭載體在HEK 293細胞中進行同源重組；更為流行的方法采用了穿梭載體與腺病毒質粒轉化一種特殊的菌株(BJ 5183)。然后從細菌中收集重組腺病毒，用其感染HEK 293細胞。雖然這些方法是可行的，但由于在HEK 293細胞中同源重組率偏低；或在轉化BJ 5183之前克隆步驟過于復雜，使這兩種方法效率偏低(下表)。?

?

同源重組

體外連接法

Viral DNA

Plasmid-based

?

制備穿梭載體和腺病毒載體

7-14天

7-14天

2-3天

目的基因從穿梭載體克隆到腺病毒載體

--

0-15天

4天

獲得重組腺病毒

14-21天

17-22天

4-7天

噬斑純化

5-10天

0-5天

--

總計

26-45天

24-56天

10-17天

??? 以體外連接方法為基礎 (by Mizuguchi和Kay)，CLONTECH的Adeno-X?表達系統提供了一種快速、高效構建重組腺病毒的方法。只需4至7天就可以獲得重組腺病毒，如圖1所示。由于經過7天的培養之后HEK 293細胞會漸漸失去對培養皿的附著而擴散，導致噬斑融合，用傳統方法制備重組腺病毒往往需要鋪平板以防止細胞擴散。而用CLONTECH的Adeno-X?表達系統只需4至7天即可得到純的重組腺病毒，這意味著無需鋪瓊脂糖平板。??? Adeno-X表達系統含有一種小而便捷的穿梭載體?pShuttle，用于克隆目的基因。這種載體的表達框兩側含有極稀少的限制性酶切位點?PI-SceⅠ和I-CeuⅠ。Adeno-X病毒DNA也含有上述兩個位點。只需把目的基因插入pShuttle的多克隆位點，然后用PI-SceⅠ和I -CeuⅠ消化載體，再將含有目的基因的pShuttle片段與Adeno-X病毒DNA(經PI-SceⅠ和I-CeuⅠ預消化為線形DNA)連接。為了提高篩選效率，用SwaⅠ酶切連接產物以除去自身環化或者其他可能存在的非線性的腺病毒DNA（SwaⅠ酶切位點在環狀Adeno-X病毒DNA的PI-SceⅠ和I-CeuⅠ位點之間）。用此DNA轉化大腸桿菌DH5α并篩選重組子。最后，用重組腺病毒DNA轉染HEK 293病毒包裝細胞系。由于從Adeno-X病毒DNA中刪除了E1基因，使其無法感染細胞，這一步需要用HEK 293包裝細胞提供反式的E1蛋白，即可得到含有目的基因、有感染能力的重組腺病毒。 ??

高效感染??? 在人原代成纖維細胞(BJ細胞)中，用Adeno-X表達系統高水平表達β-半乳糖苷酶。未純化的重組腺病毒含有來自于HEK 293細胞的lacZ基因，用于直接感染BJ細胞。將細胞培養在常規生長培養基上，48小時后染色。結果顯示，被感染的細胞高水平地表達β-半乳糖苷酶。若使用純化腺病毒(氯化銫離心可產生1012pfu/ml的效價)，可獲得更高的蛋白質表達。這不但對于更高水平的表達有用，且對于需要用更高效價的腺病毒進行感染的細胞類型也有意義。

容易篩選??? 體外連接方法減少了非重組腺病毒的產生，且無需進行費時的噬斑純化。由于SwaⅠ消化可以消除由非線性的Adeno-X病毒DNA引起的背景，因此大多數的轉化克隆含有重組腺病毒DNA。

重組腺病毒感染許多人細胞類型??? 腺病毒可效感染多種類型的靶細胞，包括除造血細胞之外所有的人細胞類型。因此，Adeno-X表達系統可用于多種研究用途，例如：基因治療研究，基因功能分析，反義治療，研制疫苗和某些轉基因動物研究。

安全操作腺病毒??? E1的缺失可幫助確定重組腺病毒不具感染性，我們仍推薦使用P2 facility以及其下的標準安全步驟。腺病毒可通過加熱或照射紫外線使其失去活性。

完整的基因表達系統??? Adeno-X表達系統包括可連接的Adeno-X病毒DNA，pShuttle載體，PI-SceⅠ和I-CeuⅠ以及雙消化緩沖液。我們同樣提供僅包含線形化的Adeno-X病毒DNA或雙消化緩沖液和酶的附屬試劑盒用于補充基礎系統。