RNAi 是一種高效的特異性強的基因表達抑制，應用RNAi生物學機制進行基因功能研究已經成為一種創新性的新方法，人們第一次可以如此快速和方便地抑制細胞中特定基因的表達水平，從而用于分析特定基因在細胞中的功能。RNAi 技術還為新藥開發、疾病治療提供了創新性的方法和途徑，有著極其廣闊的應用前景。轉染是RNAi技術應用的瓶頸。siRNA的轉染是RNAi技術最常用和最重要的轉染。由于siRNA轉染技術應用的時間不長，對廣大實驗室和研究者來說還相對陌生，即使一些有經驗的研究者也有一些疑問和困惑。

　　一、詳細實驗

　　RNA干擾（轉錄后基因沉默）實驗

　　細胞轉染實驗

　　二、常見問題解答

　　1、問：都說RNAi很容易降解，轉染效率很低。一般采用什么策略和技術來防范呢？

　　答：RNAi中，標準的非修飾的siRNA確實容易降解，這不僅在保存過程中，而且在轉染過程中。

　　對siRNA的降解，可以合成修飾的雙鏈siRNA，以提高合成中的穩定性，使用合成好的siRNA，盡量嚴格做到不要受RNA酶的污染。

　　對轉染來說，因為要接觸血清，培養基以及細胞內酶的作用。這時，好的轉染試劑作用就顯現出來了。要做到在血清中游離時，保護siRNA不受培養基中酶和蛋白的降解、吸附等影響，同時在進入細胞后不被溶酶體降解，并能釋放到細胞質中。好的轉染策略還不僅有保護的作用，更重要的是濃縮siRNA，不將細胞外的其他成分，特別是毒性成分，如抗生素、過多的蛋白帶入細胞，以避免細胞產生毒性反應，毒性對RNAi實驗來說，影響非常大。

　　2、問：最近用Entranster-R做NIH3T3細胞的siRNA轉染，沉默效率在50％左右，請問如何提高沉默效率？

　　答：不知道您的具體用量，但一般可以從幾個方面來提供沉默效率：

　　（1）優化siRNA和轉染試劑的用量。具體優化方法可以在Entranster-R的說明書上看到。經過優化后，據我們和客戶的經驗，對NIH3T3，沉默效率應該可以達到80％以上。

　　（2）在沉默的峰值點觀察結果，如在mRNA水平，可在24-48小時觀察，在蛋白水平，可在更長時間如48-72小時觀察。具體時間根據具體基因的表達情況確定。

　　（3）優化轉染時的細胞數量。轉染時較少的細胞數量，可延長觀察時間，同時避免由于細胞密集造成的抑制。

　　3、問：21nt,22nt,24nt的siRNA如何進行電泳分辨？

　　答：可以采用化學修飾的方法，比如2'羥基甲基化修飾，磷酸硫代修飾，氟代修飾等常規修飾方法，都可以保證siRNA的穩定性，當然也有學者可以在siRNA的鏈后面懸掛兩個單獨堿基T。還有就是合成和純化以及實驗操作中的盡量注意RNA降解即可。PAGE分析，即聚丙烯酰胺凝膠電泳，理論上可以分辨1bp，實際上，在引物的純化中也常用此種凝膠進行純化。但由于siRNA很容易降解，尤其在電泳時，需要接觸的液體、器皿等都很多，很容易造成在電泳過程中的降解，這樣電泳就不易分辨了。如果一定需要分辨，可以采用HPLC或質譜的方法。

　　4、問：我在做shRNA質粒，用lipo2000轉染U251細胞。這兩天做了一次，用RT-PCR來看轉染后抑制的效果。公司給我四個質粒、一個陽性對照、一個陰性對照。按照lipo的protocol，DNA：lipo比例為1：3，轉染近30個小時提的RNA。結果出來讓我有點茫然，四個質粒確實有抑制，抑制率大約在50%左右。但是問題出來了，陽性對照是針對GAPDH的，但是我陽性對照的GAPDH跑出來條帶非常亮，而陰性對照卻基本沒有GAPDH。應該不是加樣加錯了？樓主能不能幫我分析一下？

　　答：（1）四個質粒都有抑制，包括陽性和陰性對照，都在50％，如果是，陰性質粒是不應該出現抑制的，可考慮增加轉染試劑對照，即不加任何質粒，只加轉染試劑，或者換一種轉染試劑，看是否是lipo2000轉染試劑造成的抑制。（2）如果是陰性對照呈陽性，而陽性對照呈陰性，當然首先得排除操作中混淆的錯誤，可以再重復一次實驗。

　　（3）轉shRNA質粒，建議可以時間再長些，如48-72h再提RNA，觀察結果。

　　5、問：想請教下有人提到siRNA與lipofectamine2000的最適比例為1：1或1：2，這是什么比例呢？我看一般siRNA以pmol為單位，而lipofectamine2000是以ul為單位。還有就是siRNA的終濃度問題，一般文獻中提到轉染時siRNA的終濃度為100nM,這是指與稀釋后與脂質體混合后的濃度，還是指培養板中加了生長培養基后的終濃度呢？還有熒光如何計算它的轉染效率呢？那在熒光顯微鏡下怎么選取視野來計算呢？取三個視野后算平均值嗎？

　　答：不同的細胞，不同的基因，用量是不一樣的。終濃度指：細胞接觸的液體的終濃度，即含培養基的濃度。帶熒光的siRNA，可以通過熒光顯微鏡、流式細胞儀等來看。有熒光的細胞所占比例就是轉染效率。精確的方法是用FACS，熒光顯微鏡下可以選有代表性的視野估計。多選幾個視野，如你說的3個，當然更為可靠。

　　6、問：想請教個問題，我是用lipofectamine2000來轉染，細胞本身有些小黑點，但不嚴重，細胞形態功能都還可以，但是在加了轉染試劑之后細胞間就出現很多很多小黑點，背景很不干凈，實驗組，陰性對照組和Mock組都是一樣的情況，但正常組（不加轉染試劑）的細胞就很好,72h后mRNA檢測實驗組幾乎沒有抑制，請問這是轉染試劑的原因嗎？

　　答：應該先確定一下“小黑點”的性質，不過根據你的描述，應該和轉染試劑有很大關系。脂質體類的轉染試劑多對細胞毒性較大。

　　7、問：慢病毒轉染多長時間后進行干擾目的基因和蛋白的檢測？

　　答：如果用慢病毒進行瞬時表達，一般至少需要24-48小時，慢病毒基因組是RNA，需要反轉錄成DNA，再生成siRNA，再干擾，才會發生作用。這個過程和細胞類別、細胞活性、慢病毒具體載體等等有關系。建議取不同時間點檢測。另外，慢病毒一般都帶篩選基因，可以考慮做穩定表達。如果只做瞬時表達，可考慮用轉染試劑，成本、時間、方法都要省很多。

　　8、問：ipo的說明書中說到，用96孔板，可以在板內直接混合lipo、DNA，然后再加入細胞。但是有點疑問，按照說明書說的，lipo、DNA都需要和opti-MEM預混合，然后再將兩者的溶液混合孵育，不知道直接加到板子里面時，加樣順序怎么弄？是先加opti-MEM，然后加DNA，然后再加opti-MEM，再加lipo，混合孵育么？

　　答：lipo2000的說明書有好幾個版本，有一版說明書是不用于轉siRNA的，后來又改成可以轉siRNA，但推薦用RNAimax這款siRNA專用的轉染試劑，你看的應該是其96-well反向轉染的說明書。是會讓人費解。其實是，先在一個容器用opti-mem稀釋lipo，再在板子里用opti-mem直接稀釋DNA或siRNA，然后將稀釋的lipo加入到板子上，最后加細胞。

　　9、問：我最近也在做轉染，可是發現轉染后背景很臟，都是黑點（疑似黑焦蟲）在原地運動。做了LB檢測，確定該黑點不是細菌，最后發現黑點來源于抽提的質粒，請問LZ有什么辦法可以解決嗎？我已經用試劑盒重新抽提過N次質粒了還是這樣？

　　答：這種黑點，如果確定不是細菌，多是凝聚的蛋白，還有DNA等的沉淀產物，有人又把它叫“黑膠蟲”。人們看到可以動，認為是生物，其實只是布朗運動。這和血清、細胞、轉染試劑等都有關系。如果不影響實驗，可以通過換液來除去。