【摘要】 在發育或分化的不同階段以及疾病模型中，利用miRNA特異的芯片能繪制出細胞和組織的miRNA表達譜，這能夠揭示出參與了這些進程的特定miRNA。miRNA的過表達和沉默，則是一種有力的方法來研究miRNA的功能。這些研究應當在細胞內或體內進行，并與表型和基因表達分析相結合。

【關鍵詞】 miRNA 定向克隆 Dicer酶

lin-4，第一個已知的miRNA，在1993年被發現。自此，miRNA的研究就一發不可收拾。線蟲、果蠅等模式生物的研究鑒定出miRNA的許多重要功能，包括發育期間細胞增殖和死亡的協調，抗逆性，脂肪代謝等等。相對于這些低等的模式生物，哺乳動物的miRNA功能研究可就復雜得多。

在開始的幾年，科學家們的首要目標是利用克隆、生物信息學和基因表達等方法編纂出完整的miRNA目錄和它的表達方式。隨著這個目標日益接近，研究重心又轉移至miRNA功能的闡釋。針對這一目標，涌現出多種技術，有報告基因分析、原位雜交、過表達和沉默、生物信息學預測算法等，它們都有助于miRNA功能的推斷。

分析miRNA的表達

在鑒定新的miRNA時，通常采用三種方法：正向遺傳學、定向克隆和生物信息學分析。

正向遺傳學主要運用于果蠅和線蟲中，它通過一個突變表型來了解miRNA的功能。第一個miRNA基因lin-4就是這么鑒定出的。然而，正向遺傳學這么多年來也就鑒定出寥寥幾個miRNA。

這是因為miRNA很小，只要突變不影響種子序列，它們就有潛力耐受，因此很難擊中。另外，由于冗余，表型篩選不能識別很多miRNA突變體。因此正向遺傳學不可能成為鑒定miRNA的主力軍。

之后，定向克隆技術的出現，讓多種細胞系和組織中的miRNA大規模鑒定得以實現，包括人、小鼠和斑馬魚等。

miRNA的克隆流程大致如下：

在變性的聚丙烯酰胺凝膠上分離RNA樣品，并回收大小在18-25 nt的片段。接著，給RNA加上5’和3’接頭，并進行RT-PCR，然后將片段克隆到載體上，構建出cDNA文庫。對單個克隆進行測序和分析，以確定小RNA。目前測序技術的蓬勃發展也大大促進了這種方法。然而對于某些只在特定細胞類型中表達，或以低水平表達的miRNA來說，鑒定起來還是有難度的。另外，介于物理性質或轉錄后修飾，某些miRNA可能難以克隆，這也是一個棘手的問題。

同時，科學家們也開發出多種算法，來預測miRNA。所有方法都利用了二級結構信息，因為發夾結構的存在是miRNA的主要特征。

其中許多方法還依靠序列的保守性來區分miRNA候選物和無關的基因組發夾。另一些方法則評估發夾結構的熱力學穩定性，與已知miRNA的序列和結構相似度。另一種高效的方法是探索已知miRNA周圍的基因組序列，因為許多miRNA都是成簇排布。

人和小鼠的許多miRNA就是通過這種方式鑒定出的。當然，計算機預測出來的候選miRNA還需要實驗的驗證。

有時，我們并不需要全盤了解所有miRNA，而只是想了解發育或分化的不同階段、某種疾病狀態下特異表達的miRNA。這時，芯片就成為一種強大的工具，能監測組織特異的miRNA表達，幫您挑出關鍵的miRNA。

目前市場上多個miRNA芯片包括了最新的Sanger miRBase數據庫14.0版的內容，讓您能緊跟形勢。盡管最初miRNA芯片的交叉雜交和特異性為人詬病，但經過改進，很多已經能夠分辨出單個堿基的差異。

有了它，人們繪制出細胞分化期間的miRNA表達譜；有了它，人們了解到疾病狀態下異常的miRNA表達模式。ABI公司還開發出一種類似芯片的TaqMan miRNA Array，在一張微流體卡片上集合了數百個TaqMan miRNA Assay，盡管通量不如芯片高，但發揮了TaqMan分析的優勢——高靈敏度、高特異性和寬動態范圍。

鑒定miRNA的功能

miRNA的功能研究與基因相似，過表達和沉默是兩種有力的方法。miRNA的誘導表達常常是許多研究的第一步。將miRNA模擬物（多個公司有售）轉染到細胞中，就能實現miRNA的瞬時過表達。但長期研究就要依賴質粒了。這些重組質粒能源源不斷地產生有功能的miRNA，設計起來也很簡單。

利用常見的蛋白表達載體，將miRNA序列克隆上去，在Dicer酶的切割下，就能產生成熟的miRNA。一些研究小組還將這些質粒引入腺病毒或慢病毒系統，以克服原代細胞或干細胞的轉染效率低，或將miRNA導入小鼠體內。不過，僅有miRNA過表達的結論往往不讓人信服，我們還需要功能喪失（loss-of-function）實驗來證實。

對于小鼠中的miRNA研究，科學家們開發出一些遺傳方法，來產生功能喪失的突變。

目前主要有三種：

(1) Dicer酶的突變，讓所有成熟的miRNA都缺失；

(2) 小鼠中miRNA基因的敲除；

(3) miRNA 靶位點的突變。不過，miRNA的高度冗余讓這種功能喪失研究面臨不小的挑戰。而且，許多miRNA是成簇排列的，一個miRNA的缺失或干擾可能會影響多順反子轉錄本的正確折疊和加工，從而影響相鄰miRNA的表達。近年來使用較多的是反義靶定的非遺傳學方法。多個公司提供miRNA抑制劑。這些2’-O-甲基修飾的寡核苷酸不可逆地抑制了miRNA的功能。

上述方法提供了miRNA體外和體內功能研究的框架。在發育或分化的不同階段以及疾病模型中，利用miRNA特異的芯片能繪制出細胞和組織的miRNA表達譜，這能夠揭示出參與了這些進程的特定miRNA。miRNA的過表達和沉默，則是一種有力的方法來研究miRNA的功能。這些研究應當在細胞內或體內進行，并與表型和基因表達分析相結合。

與轉錄因子類似，miRNA也是一大類基因調控分子。它們獨特的作用方式需要新的分析策略。系統鑒定miRNA以及研究特定miRNA過表達或沉默的生物影響的技術已經有了，但是還需要了解影響miRNA功能的信號通路，以及影響miRNA表達的環境因素或遺傳因素。一旦獲得這些信息，研究人員才有可能設計出新的治療策略，來治療遺傳和獲得性疾病。