在RNAi過程中，siRNA會識別mRNA上的靶點區域，并引導AGO等多種蛋白在該區域組成一個沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），在該區域的特殊位點將mRNA切開，造成mRNA降解，但這個靶點識別、切割及釋放的具體過程及分子機制并不清晰。

7月2日發布的Molecular Cell中，來自東京大學和第三軍醫大學的研究者利用單分子成像分析技術，成功地解析了RISC的工作過程。

本項研究中，研究者首先構建了不同熒光標記的mRNA和siRNA，且它們所攜帶的熒光標記能夠產生熒光能量共振轉移，借助特殊的單分子成像分析技術檢測不同時間段線蟲細胞中熒光信號強度，研究者即可判斷出RISC具體狀態。

實驗結果表明，在RNAi最初的識別階段，RISC主要依靠siRNA 5’ seed region來識別mRNA靶點區域，5’ seed region突變會大大提高RISC靶點識別時間，而3’ supplementary region則主要負責阻止RISC進入剪切狀態，可能與避免siRNA產生脫靶效應有關。

在RISC結合到mRNA靶點區域后，則有可能基于siRNA 5’ seed region和3’ supplementary region內序列GC含量差別產生兩種剪切釋放形式：若5’ seed region中GC含量相對較高，RISC會將mRNA剪切位點至3’端片段釋放。

保留mRNA與siRNA的3’端supplementary region的配對狀態，若3’ supplementary region中GC含量相對較高，RISC則會將mRNA剪切位點至5’端片段釋放，保留mRNA與siRNA的5’端seed region的配對狀態。

單分子分析判斷RISC剪切形式

本項研究利用單分子成像分析技術，對RNAi整個過程的分子機制模型進行了完善，利用此技術，研究者已經可以實時地“看到”RNAi靶點識別、剪切、釋放整個過程，并對siRNA中不同區域突變與GC含量對RISC剪切模式的影響進行了深度探索，為后續RNAi技術的完善提供了更多新的理論與實驗結果，具有重要研究意義。

名詞解釋：熒光能量共振轉移

熒光能量共振轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET）是距離很近的兩個熒光分子間產生的一種能量轉移現象。

當供體熒光分子的發射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內時，就會發生一種非放射性的能量轉移，即FRET現象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發射的熒光卻大大增強（敏化熒光）。

相關文獻：Yao C, Sasaki H M, Ueda T, et al. Single-Molecule Analysis of the Target Cleavage Reaction by the Drosophila RNAi Enzyme Complex[J]. Molecular Cell, 2015, 59(1): 125-132.