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繼分析DNA的Southern雜交方法出現后，1977年Alwine等人提出一種與此相類似的、用于分析細胞總RNA或含poly A尾的RNA樣品中特定mRNA分子大小和豐度的分子雜交技術，這就是與Southern相對應而定名的Northern雜交技術。這一技術自出現以來，已得到廣泛應用，成為分析mRNA最為常用的經典方法。 ?? 與Southern雜交相似，Northern雜交也采用瓊脂糖凝膠電泳，將分子量大小不同的RNA分離開來，隨后將其原位轉移至固相支持物（如尼龍膜、硝酸纖維膜等）上，再用放射性（或非放射性）標記的DNA或RNA探針，依據其同源性進行雜交，最后進行放射自顯影（或化學顯影），以目標RNA所在位置表示其分子量的大小，而其顯影強度則可提示目標RNA在所測樣品中的相對含量（即目標RNA的豐度）。但與Soughern雜交不同的是，總RNA不需要進行酶切，即是以各個RNA分子的形式存在，可直接應用于電泳；此外，由于堿性溶液可使RNA水解，因此不進行堿變性，而是采用甲醛等進行變性電泳。雖然Northern也可檢測目標mRNA分子的大小，但更多的是用于檢測目的基因在組織細胞中有無表達及表達的水平如何。 一、 試劑準備 1.??? 0.5M EDTA: EDTA 16.61g加ddH2 O至80ml, 調pH至8.0, 定容至100ml。 2． 50mM NaAc: NaAc 3.4g 加ddH2 O至500ml, 加DEPC 0.5ml, 振蕩, 37℃過夜，高壓滅菌。 3． 5×甲醛凝膠電泳緩沖液: MOPS [3-(N-瑪琳代)丙磺酸] 10.3g加50mM NaAc 400ml, 用2N NaOH調pH至7.0, 再加入0.5M EDTA 10ml, 加DEPC H2 O至500ml。無菌抽濾，室溫避光保存。 4． 20×SSC: NaCl 175.3g、檸檬酸三鈉88.2g，加ddH2 O至800ml，用2N NaOH調pH至7.0，再用ddH2 O定容至1000ml。DEPC處理、高壓滅菌。 5. 6×SSC: 20×SSC 300ml加ddH2 O至1000ml。DEPC處理,高壓滅菌。 6．50×Denhardt : 聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白(BSA)0.5g加dd H2 O至50ml,無菌抽濾、分裝。 7．1M Na2 HPO4: Na2 HPO4 ?12H2 O 35.81g, 加dd H2 O至100ml。 8. 1M NaH2 PO4: NaH2 PO4 ?2H2 O 15.6g, 加dd H2 O至100ml。 9. 0.1M 磷酸鈉緩沖液(pH 6.6): Na2 HPO4 35.2ml加NaH2 PO4 64.8ml 。 10.STE緩沖液: 1M Tris-HCl(pH 8.0) 2.5ml,0.5M EDTA, 0.5ml,5M NaCl 5ml，加dd H2 O至250ml。 11.預雜交液: 20×SSC 5ml,甲酰胺10ml,50×Denhardt 4ml,1M磷酸鈉緩沖液0.2ml（pH6.6）,10%SDS 1ml, 總體積 20ml。臨用前加入變性鮭魚精DNA（10mg/ml）,使終濃度為4μl/ml。 12. DEPC H2 O: 1000mldd H2 O中加入DEPC 1ml，充分振蕩，37℃過夜，高壓滅菌。 二、 操作步驟 1. 總RNA提取：見相關內容。 2.? 變性膠的制備：取瓊脂糖0.2g，加入DEPC H2 O 12.4ml，加熱熔化，于保溫狀態下加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混勻、制膠。待膠凝固后，置1×甲醛凝膠電泳緩沖液中預電泳5min。 3. 樣品制備：取總RNA4.5μl(約20-30μg) ，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液 4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃溫育15min、冰浴5min。加入EB（1μg/μl）1μl、上樣緩沖液2μl。 4. 電泳：上樣，50V電泳（電泳時間約2hr左右）。電泳結束后將膠塊置紫外燈下，觀察RNA的完整性，記錄18S、28S條帶的位置（離加樣孔的距離）。 5.??? 將RNA從變性膠轉移到硝酸纖維素膜或尼龍膜： (1) 按膠塊大小剪取膜一張，用DEPC水中浸濕后，置于20×SSC中浸泡1hr。剪去膜一角。 (2)將膠塊切去一角，并在20×SSC浸泡15min×2次。 (3)用長和寬均大于凝膠的一塊有機玻璃板作為平臺，將其放入大的干烤皿上，上面放一張Whatman 3MM濾紙，倒入20×SSC使液面略低于平臺表面，當平臺上方的3MM濾紙濕透后，用玻棒趕出所有氣泡。 (4)將凝膠翻轉后置于平臺上濕潤的3MM濾紙中央，3MM濾紙和凝膠之間不能滯留氣泡。 (5)用Parafilm膜圍繞凝膠四周，以此作為屏障，阻止液體自液池直接流至膠上方的紙巾。 (6) 在凝膠上方放置預先已浸濕的尼龍膜，排除膜與凝膠之間的氣泡。 (7) 將二張已濕潤的、與凝膠大小相同的3MM濾紙置于膜的上方，排除濾紙與濾膜之間的氣泡。 (8) 將一疊（5-8cm厚）略小于3MM濾紙的紙巾置于3MM濾紙的上方，并在紙巾上方放一塊玻璃，然后用一個重約500克的重物壓在玻璃板上。其目的是建立液體自液池經凝膠向膜上行流路，以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在膜上。 6. 使上述RNA轉移持續進行15hr左右。在轉膜過程中，當紙巾浸濕后，應更換新的紙巾。 7. 轉移結束后，揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙。將膜在6×SSC中浸泡5 min，以去除膜上殘留的凝膠。 8. 將凝膠置紫外燈下，觀察膠塊上有無殘留的RNA。 9.膜置80℃，真空干烤1-2hr。烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存備用。 10. 探針標記(Prime-a-Gene Labeling System, Promega公司)： （1）? 取模板DNA 25ng于0.5ml離心管中，95-100℃變性5min，冰浴5min。 （2）? dNTPmix的制備: 取dGTP 1μl、dATP 1μl、dTTP 1μl混勻。 （3）將下列反應成份混合，加入上述微量離心管中： ????? dNTPmix??????? ??? 2.0μl ????? BSA(10mg/ml )?? ?? 2.0μl ????? 5×buffer?????? ? 10.0μl ????? Klenow 酶(5u/μl) 1.0μl ????? α-32 P-dCTP????? ?? 5.0μl ??? 加入適量dd H2 O使反應總體積達50μl，輕輕混勻。室溫下反應1hr。 11.預雜交：將膜的反面緊貼雜交瓶，加入預雜交液5ml，42℃預雜交3hr。 12.雜交：將變性的探針（95-100℃變性5min，冰浴5min）加入到預雜交液中，42℃雜交16hr。 13.洗膜： ? (1)傾去雜交液。 ? (2)2×SSC/0.1%SDS室溫洗15min。 ? (3)0.2×SSC/0.1%SDS，55℃洗15min×2次。 14.壓片：將膜用dd H2 O漂洗片刻，用濾紙吸去膜上水份。用薄型塑料紙將膜包好，置于暗盒中，在暗室中壓上X光片。暗盒置-70℃放射自顯影3～7天左右。 三、 注意事項 1． 操作時必須仔細、小心，嚴格按同位素操作規程進行，以防止同位素污染。 2． 必要時，可采用Sephades G-50柱層析法純化標記的探針（見本節附錄），以去除標記反應中未結合的（游離的）核苷酸。 3． 膜的重復使用：結合了待測RNA的膜與探針雜交后，可經堿或熱變性方法將探針洗脫，膜可反復使用與其它探針雜交。方法如下：雜交的膜（注意：雜交過的膜在保存過程中不能干燥，否則探針將會與膜形成不可逆的結合）置 100℃ 0.5% SDS中煮沸3min，自然冷卻至室溫后，將膜放入雙蒸水中漂洗2-3遍。取出膜，用濾紙吸去膜表面的水份。將膜直接進行另一種探針的雜交或用保鮮膜包好，室溫下真空保存。

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