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第七課 液相色譜儀 氣相色譜法是一種很好的分離、分析方法，它具有分析 速度快、分離效能好和靈 敏度高等優點。但是氣相色 譜僅能分析在操作溫度下能汽化而不分解的物質。據估 計，在已知化合物中能直接進行氣相色譜分析的化合物 約占15％，加上制成衍生物的化合物，也不過20％左右。 對于高沸點化合物；難揮發及熱不穩定的化合物、離子 型化合物及高聚物等，很難用氣相色譜法分析。為解決 這個問題，70年代初發展了高效液相色譜。高效液相色 譜的原理與經典液相色譜相同，但是它采用了高效色譜 拄、高壓泵和高靈敏度檢測器。因此，高效液相色譜的 分離效率、分析速度和靈敏度大大提高。 就其分離機 理的不同，高效液相色譜可以分為液－固吸附色譜、 液－液分配色譜、 離子交換色譜和凝膠滲透色譜四類。 液―固色譜的色譜柱內填充固體吸附劑，由于不同組分 具有不同的吸附能力，因此， 流動相帶著被測組分經 過色譜柱時，各組分被分開。 液―液色譜的流動相和 固定相都是液體。作為固定相的液體涂在惰性擔體上， 流動 相與固定液不互溶。當帶有被測組分的流動相進 入色譜柱時，組分在兩相間很快達分配平衡，由于各 組分在兩相間分配系數不同而彼此分離。以非極性溶 液作流動相，極性物質作固定相的液―液色譜叫正相 色譜；極性溶液作流動相，非極性物質作固定相的液 ―液色譜叫反相色譜。 離子交換色譜的色譜柱內填充 離子交換樹脂，依靠樣品離子交換能力的差別實現分 離。而凝膠色譜是按試樣中分子大小的不同來進行分 離的。 在上述四類色譜中，應用最廣泛的是液―液色 譜，因此，在本節的討論中以液―液 色譜為主。 高 效液相色譜的基本理論和定性定量分析方法與氣相色譜基本相同。高效液相色譜儀由輸液系統、進樣系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統組成。 第八課 液相色譜儀－輸液系統 輸液系統 高效液相色譜的輸液系統包括流動相貯存器、高壓泵和梯度淋洗裝置。流動相貯存器為不銹鋼或玻璃制成的容器，可以貯存不同的流動相。高壓泵是高效液相色譜儀最重要的部件之一。由于高效液相色譜儀所用色譜柱直徑細，固定相粒度小，流動相阻力大，因此，必須借助于高壓泵使流動相以較快的速度流過色譜這。高壓泵需要滿足以下條件：能提供150－450kg/cm2的壓強；流速穩定，流量可以調節；耐腐蝕。目前所用的高壓泵有機械泵和氣動放大泵兩種。梯度淋洗裝置可以將兩種或兩種以上的不同極性溶劑， 一定程序連續改變組成，以達到提高分離效果，縮短分離時間的目的。它的作用與氣相色譜中的程序升溫裝置類似。 梯度淋洗裝置分為兩類：一類叫外梯度裝置；一類內梯度裝置。外梯度裝置是流動相在常壓下混合，靠一臺高壓泵壓至色譜柱；內梯度裝置是先將溶劑分別增壓后，再由泵按程序壓入混合室，再注入色譜柱。 第九課 液相色譜儀－ 進樣系統，分離系統進樣系統一般高效液相色譜多采用六通閥進樣。先由注射器將樣 品常壓下注入樣品環。然后 切換閥門到進樣位置，由高壓泵輸送的流動相將樣品送人色譜柱。樣品環的容積是固定的，因此進樣重復性好。 分離系統 分離系統包括色譜柱、連接管、恒溫器等。色譜柱是高效液相色譜儀的心臟。它是 由內部拋光的不銹鋼管制成，一般長10―50cm，內徑2―5mm，柱內裝有固定相。液相色譜的固定相是將固定該涂在擔體上而成。擔體有兩類：一類是表面多孔型擔體；另一類是全多孔型擔體。 近年來又出現了全多孔型微粒擔體。這種擔體檢度為5―10 um，是由nm級的硅膠微粒堆積而成，又叫堆積硅珠。由于顆粒小，所以柱效高，是目前最廣泛使用的一種擔體。 在高效液相色譜分析中，適當提高柱溫可改善傳質，提高桂效，縮短分析時間。因 此，在分析時可以采用帶有恒溫加熱系統的金屬夾套來保持色譜拄的溫度。溫度可以在室溫到60℃間調節。

第十課 液相色譜儀－檢測系統 檢測系統 高效液相色譜的檢測器很多，最常用的有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器等。 (1)紫外檢測器 紫外檢測器是液相色譜中應用最廣泛的檢測器，適用有紫外吸收物質的檢測。在進 行高效液相色譜分析的樣品中，約有80％的樣品可以使用這種檢測器。紫外檢測器的工作原理如下：由光源產生波長連續可調的紫外光或可見光，經過透鏡和遮光板變成兩束平行光，無樣品通過時，參比池和樣品池通過的光強度相等，光電管輸出相同，無信號產生；有樣品通過時，由于樣品對光的吸收，參比池和樣品池通過的光強度不相等，有信號產生。根據朗伯―比爾定律，樣品濃度越大，產生的信號越大， 這種檢測器靈敏度高，檢測下限約為 10(-10) g／ml，而且線性范圍廣，對溫度和流速不敏感，適于進行梯度洗脫。 (2)示差折光檢測器 示差折光檢測器是根據不同物質具有不同折射率來進行組分檢測的。凡是具有與流動 相折射率不同的組分，均可以使用這種 檢測器。如果流動相選擇適當，可以檢測所有的樣品組分。示差折光檢測器分為反射式和沂射式兩種。反射式示差折光檢測器是根據下述原理制成的：光在兩種不同物質界面的反射百分率與入射角和兩種物質的折射率成正比。如果入射角固定，光線反射百分率僅與這兩種物質的沂射率成正比。光通過僅有流動相的參比池時，由于流動相組成不變，故其折射率是固定的；光通過工作池時，由于存在待測組分而使折射串改變，從而引起光強度的變化，測量光強度的變化，即可測出該組分濃度的變化。偏轉式示差折光檢測器是根據下述原理：當一束光透過折射率不同的兩種物質時，此光束會發生一定程度的偏轉，其偏轉程度正比于兩物質折射率之差。 示差折光檢測器的優點是通用性強，操作簡便；缺點是靈敏度低，最小檢出限約為 10(-7)g/ml ，不能做痕量分析。此外，由于洗脫液組成的變化會使折射率變化很大，因此，這種檢測器也不適用于梯度洗脫。 (3)熒光檢測器 物質的分子或原子經光照射后，有些電子被激發至較高的能級，這些電子從高能級 躍至低能級時，物質會發出比入射光波長較 長的光，這種光稱為熒光。在其他條件一定的情況下，熒光強度與物質的濃度成正比。許多有機化合物具有天然熒光活性，另外，有些化合物可以利用柱后反應法或柱前反應法加入熒光化試劑，使其轉化為具有熒光活性的衍生物。在紫外光激發下，熒光活性物質產生熒光，由光電倍增管轉變為電信號。 熒光檢測器是一種選擇性檢測器，它適合于稠環芳烴、氨基酸、胺類、維生素、蛋 白質等熒光物質的測 定。這種檢測器靈敏度非常高，其檢出限可達10(-12)_10 (-13)g/ml，比紫外檢測器高2―3個數量級，適合于痕量分析 。而且可以用于梯度洗脫。其缺點是適用范圍有一定的局限性。

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