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第一節　自身抗體的免疫組織化學檢測方法

1．常規檢查法－間接免疫熒光檢查方法

（1）取大白鼠的肝、腎、心、小白鼠胃，人甲狀腺，橫紋肌等單獨或制成復合冰凍切片（4～5μm，）。其中1片用56℃甲醇固定3min，另切一片不固定，分別放入濕盒中。

（2）將病人血清用0.01mol/l Ph7.2～7.4磷酸緩沖鹽水（PBS）作1：5稀釋，滴加覆蓋抗原切征，置濕盒中，37℃，30～60min。

（3）切片用PBS洗2次，每次5min。用電磁攪拌或振蕩幫助洗凈不參與反應的血清蛋白。吹干。

　　（4）滴加抗人IgG或γ-球蛋白熒光抗體（用0.01%伊文氏藍稀釋）覆蓋切片，37 ℃ 中放置30min。

（5）用PBS洗2次，方法同步驟（3），隨后，再用蒸餾水洗1min。

（6）緩沖甘油（pH9.0～9.5,PBS或碳酸鹽緩沖液1份和1份甘油混合）封片。

2．對照試驗可作空白，替代，一步法抑制或吸收等對照，以證明陽性結果的特異性。

3．熒光顯微鏡檢查陽性熒光呈明亮的黃綠色熒光，抗原組織成分呈現出陽性熒光時，即證明病人有對該組織成分的自身抗體，如細胞核呈明亮的黃綠色熒光即報告抗核抗體陽性。對陽性結果根據需要可進一步作滴度檢查。

近來一些報告認為用培養細胞作某些自身抗體檢查，可以取得良好的效果。

在檢查自身抗體中常常可出現某種非特異性熒光，如粘液腺分泌物，粘液細胞，白細胞，胃粘膜表現的食物殘渣，心肌異嗜性抗體反應等，以及有時用大白鼠胃組織切片出現的壁細胞非特異熒光等，容易引起混淆。這些問題都可通過對照試驗（包括用正常人血清）和觀察者的經驗加以排除。

4．結果報告　　根據熒光顯微鏡觀察的結果一是形態特征，二是熒光的亮度。在報告時先報告陽性熒光的形態名稱加抗體如抗核抗體，再描述熒光亮度，主要靠觀察者的主觀目測，可分陰性和陽性兩種結果，陽性又可分“+”為可見較弱的熒光，“++”為明亮的熒光，“+++”為耀眼的熒光。雖然這樣的目測記錄精確度可能在不同觀察者之間有差別，但經過訓練和有較多的觀察經驗后，這種方法基本上是可靠的，也便于推廣應用。

近年使用熒光顯微分光光度計和圖像分析儀等定量檢測方法，結果比較客觀，將結果打印報告更適合于臨床診斷和科學研究，應爭取采用這些先進儀器和方法，改進結果的判斷，記錄和報告。

5．免疫酶組織化學檢測自身抗體方法免疫酶組織化學間接法可以代替免疫熒光法用于自身抗體的檢測，但尚未普遍采用。其優點是可以用普通顯微鏡觀察結果，更適合于基層實驗室使用，標本也可長期保存。

（1）抗原（與免疫熒光法相同）。

（2）操作方法：

①抗原切片先用0.01mol/L pH7.4PBS洗1次，吹干，放入濕盒中。

　　②滴加1：5稀釋的待檢血清，37 ℃ ，30min。

③PBS洗2次，每次5min，吹干。

　　④滴加適當稀釋的酶標記A蛋白或抗人IgG抗血清，37 ℃ ，30min。

⑤用辣根過氧化物酶底物顯色（同前述免疫酶法），室溫10min。

⑥水洗。

⑦0.1%伊文氏藍或蘇木精染色5min。

⑧水洗，常規酒精脫水，透明封片。

　　結果：陽性為棕色，陰性為藍色。在第3步之后可用1%H 2 O 2 作用15min消除內源酶干擾。

6．自身抗體的聯合檢測方法在血清中存在的多種自身抗體，可用多種組織抗原組合制作成復合抗原檢測。抗原組成可包括以下組織：

（1）肝臟：①檢出抗核抗體；②抗肝細胞膜抗體；③抗膽管上皮細胞抗體；④抗核仁抗體等。可用大鼠或小鼠肝組織。

（2）胃：①檢出胃壁細胞抗體；②平滑肌抗體；③抗核抗體。必須用小鼠胃組織。

（3）甲狀腺組織：①檢出甲狀腺球蛋白抗體；②檢出甲狀腺微粒體抗體；③檢出抗第二膠質抗體；④檢出抗核抗體。可用人、猴、兔等甲狀腺組織。

（4）腎：①檢出線粒體抗體（遠端腎小管）；②抗核抗體；③抗基底膜抗體。

（5）心肌：抗心肌抗體。

（6）橫紋肌：①肌無力全并胸腺瘤A帶（暗帶）抗體；②肌無力I帶（明帶）抗體和H帶抗體；③肌無力白纖維骨骼肌抗體；④肌無力骨骼肌紅纖維抗體。

（7）人結腸；抗結腸粘膜抗體。

（8）胰腺：胰腺細胞抗體。

（9）腎上腺：腎上腺皮質細胞抗體。

（10）神經組織：根據需要將多種抗原組合。

按間接法進行檢測，如發現某種自身抗體，再作滴度測定，這是一種聯合篩選試驗，十分簡便，已作常規應用。

7．微波增敏快速自身抗體檢測方法近年微波技術用于免疫組織化學檢測自身抗體方法，取得了良好的效果。微波是一種高頻電磁波，經微波輻射引起離子極化，旋轉，分子間磨擦，使能量發生轉換，產生熱能而加快了抗原抗體反應的速度，適用于臨床快速檢驗和診斷。

（1）抗原切片（同免疫熒光法）。

（2）微波增敏快速方法

①抗原切片先用PBS洗，吹干，放入濕盒中（用有機玻璃制作，內放少許蒸餾水）。

②滴加1：5稀釋的待檢血清，將濕盒移入微波爐內轉盤上，調中檔微波強度輻射1min，放置5min。

③PBS洗2次，各1min。

④熒光抗體反應1min（同步驟2），放5min 。

⑤PBS洗2次，各1min。

⑥緩沖甘油封片。熒光顯微鏡檢測。

（3）結果：陽性為黃綠色熒光，陽性為紅色。微波爐型號不同，應經預實驗選定強度和時間。

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