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葉綠體 mRNA3’ 末端的體外加工

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l????? RNA 加工反應

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1． 在 1.5ml 微量離心管中加入下列反應液：

緩沖液 IVT （ 20 ×） ??????????????????????????? 0.5 μ l

葉綠體蛋白提取物（ 20 μ g ） ????????????????????? L μ l

緩沖液 E??????? ??????????????????????????????? M μ l

（ L ＋ M ＝ 5 μ l ）

DEPC 處理過的水 ??????????????????????????????? X μ l

H-RNA （約 0.25fmol ，每分鐘計數 2000 ） ?????????? Y μ l

（ X ＋ Y ＝ 4.5 μ l ）

以加入 H － RNA 起始反應，溫和混勻，短暫離心使反應液從管壁上甩下來。

注：

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緩沖液 IVT （ 20 ×）： 200 mmol/L KCl, 75 mmol/L MgCl2, 40 mmol/L 二硫蘇糖醇（ DTT ） ? 用 DEPC 處理后高壓滅菌。

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緩沖液 E ： 20 mmol/L HEPES （ pH7.9 ）， 60 mmol/L KCl, 12.5 mmol/L MgCl2, 0.1 mmol/L EDTA, 2mmol/L 二硫蘇糖醇（ DTT ）， 17 ％甘油 ?? 用 DEPC 處理后高壓滅菌。

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2． 25 ℃溫育 60 分鐘（或對于動力學實驗為 0 ～ 60 分鐘）。

3． 將 5 μ l 反應液中移入 45 μ l 終止液以終止反應，混勻，置于冰上。

終止反應液：

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6 mol/L 尿素

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1 ％十二烷基硫酸鈉（ SDS ）

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4.5 mmol/L 玫瑰紅三羧酸 ???

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用 DEPC 處理并高壓滅菌

4． 加入 50 μ l 酚 / 氯仿 / 異戊醇（ 25 ： 25 ： 1 ），混勻，室溫下離心 2 分鐘。把上層水相（紅色）移到新離心管中，棄掉酚相。

5． 再加入 1 μ l 3mol/L 乙酸鈉（ pH5.5 ）， 1 μ l 10mg/ml tRNA ， 125 μ l 100 ％冰冷乙醇。－ 20 ℃放置 10 分鐘后， 4 ℃離心 10 分鐘。

6． 小心移去上清，將 RNA 沉淀真空干燥約 5 分鐘后，重懸 RNA 于 7 μ l 甲酰胺染液中。

7． 沸水浴煮 RNA 重懸液 3 分鐘，冰上快速冷卻。

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l????? 用 PAGE 分析 RNA 產物

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1． 準備電泳裝置，用洗滌劑洗玻璃板（ 18cm × 18cm × 0.08cm ），依次用水，蒸餾水和乙醇沖洗，然后空氣晾干。

2． 制備 6 ％丙稀酰胺凝膠液：

溶液 A??????????????????????????????????? 4.8ml

溶液 B??????????????????????????????????? 7.2ml

APS （ 20 ％） ?????????????????? ??????????? 55 μ l

TEMED??????????????????????????????????? 8 μ l

倒膠，插入梳子，丙稀酰胺將 30 分鐘內完全聚合。

注：

溶液 A ： 5 × TBE （用 10 × TBE 貯液）， 7 mol/L 尿素， 15 ％丙稀酰胺， 0.75 ％雙丙稀酰胺

溶液 B ： 0.5 × TBE （用 10 × TBE 貯液）， 7mol/L 尿素

3． 電泳緩沖液為 0.5 × TBE ， 30mA 下，預電泳直到溫度上升為 50 ℃或電壓上升至 1000V （需要約 20 分鐘）。

4． 用電泳緩沖液沖洗泳道以除去預電泳中擴散匯集于泳道的尿素。上 RNA 樣，在 20mA 下走膠至溴酚藍到達膠的底部（ 20 ～ 30 分鐘）。

5． 小心地分開上下玻璃板，把膠移到 Whatman 3MM 紙上，蓋上 Saran? 膜，再放上一層 Whatman 3MM 紙于 Saran? 膜上，置于凝膠干燥器上干燥。

6． 用增感屏于－ 80 ℃，干凝膠 X 光片曝光 6 ～ 15 小時。

蛋白質與 RNA 的交聯

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l????? UV 交聯反應

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1． 在 1.5ml 微量離心管中加入下來反應物（ X-RNA 除外）：

緩沖液 IVT （ 20 ×） ???????????????????????????? ? 0.75 μ l

葉綠體蛋白提取物（ 20 μ g ） ?????????????????????? ? ? L μ l

緩沖液 E????????????????????????????????????????? M μ l

（ L ＋ M ＝ 7.5 μ l ）

poly （ U ）（ 0.1mg/ml ） ??????????????????????????? ? ? 1 μ l

DEPC 處理過的水 ?? ??????????????????????????????? X μ l

X-RNA （約 1.25fmol, 每分鐘計數 100 000 ） ?????????? ? Y μ l

（ X ＋ Y ＝ 6.5 μ l ）

總體積： ???????????????????????????????????? ? ? 15.75 μ l

室溫下放置 5 分鐘，加入 X-RNA ，溫和混合，短暫離心，將反應液從管壁上甩下來。

2． 室溫下放置 10 分鐘。

3． 小心地打開管蓋，放至 UV 交聯儀下，在工作功率 1.8J （即刻度為 2 × 9000 ）進行 UV 交聯，如果沒有 UV 交聯儀，可在殺菌燈下 6cm 照 30 分鐘。

4． 加入 1 μ l 0.5mg/ml RNase A 液，在 37 ℃溫育 20 分鐘。

5． 加入 4 μ l × Laemmli 樣品緩沖液，在 80 ～ 100 ℃下處理樣品 1 分鐘。

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l????? 蛋白質的 SDS － PAEG 電泳分析

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1． 準備制膠裝置，洗玻璃板，可選用 18cm × 18cm × 0.08cm 玻璃板或 8cm × 10cm （微型凝膠）玻璃板。

2． 制備 13 ％丙稀酰胺分離膠溶液：

丙稀酰胺（ 30 ％） / 雙丙稀酰胺（ 0.8 ％） ?????????????? 8.7ml

H2 O????????????????????????????????????????????? 8.8ml

分離膠緩沖液（ 8 ×） ?????????????????????????????? 2.5 μ l

APS （ 20 ％） ??????????????????????? ??????????????? 75 μ l

TEMED??????????? ?????????????????????????????? ? 30 μ l

3． 制備濃縮膠溶液：

丙稀酰胺（ 30 ％） / 雙丙稀酰胺（ 0.8 ％） ????????????? ?? 1.3ml

H2 O??????????????? ??????????????????????????????? 3.9ml

濃縮膠緩沖液（ 4 ×） ???????????????????????????? ?? ? 1.8ml

APS （ 20 ％） ?????????????????? ????????????????????? 45 μ l

TEMED???????????? ??????????????????????????????? ? 10 μ l

4． 在 20mA 直流下電走膠直至溴酚藍到達膠的底部（ 2 ～ 3 小時）。

5． 小心分開玻璃板，把膠移入玻璃皿中，按下列程序銀染蛋白。

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l????? 陽性成像銀染

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按 Merril 等 1984 的方法，下述的步驟均在室溫下進行。

1． 在含有 50 ％甲醇 /12% 冰乙酸的 400ml 水溶液中處理 10 分鐘以固定凝膠。換用新溶液重復一次。

2． 在含有 10 ％甲醇 /5 ％冰乙酸水溶液 400ml 中處理 10 分鐘以漂洗凝膠。換用新溶液重復一次。

3． 將膠浸入含 3.4mmol/L 重鉻酸鉀 /3.2mmol/L 硝酸 200ml 水溶液中 15 分鐘。

4． 將膠浸入含 12mmol/L 硝酸銀的 150ml 水溶液中，放置 15 分鐘。

5． 用水漂洗 3 次。

6． 在含有 0.5ml 37 ％甲醛溶液的 0.28mol/L 碳酸鈉 150ml 溶液中快速洗膠兩次后，換上 150ml 新鮮溶液，讓凝膠顯像 3 ～ 15 分鐘。

7． 去掉顯像劑，加入 200ml 3 ％乙酸水溶液，放置 5 分鐘終止顯像。

8． 用 5 ％甘油 200ml 水溶液漂洗成像凝膠 10 分鐘。

9． 在約 80 ℃凝膠干燥器上干燥成像凝膠，用增感屏－ 80 ℃對 X 光片曝光過夜。

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