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聚丙酰胺凝膠電泳

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中性聚丙烯酰胺凝膠電泳

安裝電泳裝置和配制凝膠溶液

1.????? 必要時可用 KOH/ 甲醇清洗玻璃板和間隔片。

2.????? 用溫熱的去污劑溶液洗滌玻璃板和間隔片，再充分漂洗，先用自來水，再用去離子水。應拿取玻璃的邊緣部分或帶手套操作，以免手上的油脂殘留在玻璃板的工作面上。用乙醇沖洗玻璃板，并將其置于一邊晾干。

3.????? （可做可不做）其中一塊玻璃板的一面用硅化液處理（如 Sigmacote 或 Acrylease ）：在化學通風廚內，將玻璃板放于一疊紙巾上，倒少量硅化液于其表面上，用 Kimwipes 紙巾涂抹均勻，然后用去離子水沖洗、紙巾擦干。

4.????? 安裝玻璃與間隔片：

a.?????? 將較大的（不帶凹口）玻璃板平放在實驗臺上，在玻璃板的兩側將間隔片平行置于其邊緣放妥。

b.????? 用凡士林輕涂以助于間隔片在后面的操作中保持原位。

c.?????? 將內板（帶凹口的玻璃板）在間隔片上放妥。

d.????? 用夾子或鐵皮制紙夾將玻璃板加在一起，將整塊玻璃的兩邊及底部用凝膠密封帶封緊，形成不透水密封。

5.????? 根據玻璃板的大小和間隔片的厚度計算所需凝膠的體積。

6.????? （可做可不做）將所需用量的聚丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰溶液放于一干凈的帶側臂的燒瓶中，加入磁力攪拌子，抽真空脫氣。開始脫氣應溫和一些，并邊脫氣邊旋轉燒瓶直至不再有氣泡溢出為止。

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灌制凝膠

7.????? 下面的操作需要戴手套，在托盤上進行，以免濺出的丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰溶液灑在實驗臺上。動作應迅速，于丙烯酰胺聚合前完成。

a.?????? 每 100ml 丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰溶液中加入 35 μ l TEMED ，輕輕旋轉混勻溶液。

b.????? 用 50ml 注射器吸取凝膠溶液，調轉注射器，排凈進入針管的空氣。將注射器的針頭插入兩塊玻璃板之間的空隙，注入丙烯酰胺溶液，幾乎注滿改空隙。

c.?????? 將玻璃板斜靠在試管架上，與實驗臺面成約 10 °角。

8.????? 立即將合適的梳子插到凝膠中，小心勿使梳齒下留有泡。梳子的頂端應略高于玻璃板的上沿。用鐵皮制紙夾將梳子夾緊，使其就位。必要時，用剩余的丙烯酰胺溶液完全充滿模具。確認無丙烯酰胺溶液從模具漏出。

9.????? 丙烯酰胺于室溫聚合 30~60min 。若凝膠回縮明顯，應補加丙烯酰胺：亞甲雙丙烯酰溶液。

10.? 聚合完全后，用 1 × TBE 浸潤的紙巾包繞梳子和凝膠的頂部。然后用 Saran Wrap 模密封整塊凝膠， 4 ℃保存，直至使用。

11.? 當準備好進行電泳時，在梳子的周圍及其頂部噴些 1 × TBE 緩沖液，從聚合的凝膠中小心取出梳子。用注射器吸取 1 × TBE 沖洗加樣孔。用剃須刀或解剖刀除去凝膠底部的密封膠帶。

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上樣與電泳

12.? 將凝膠放入電泳槽中，用大號鐵皮制夾子夾住其邊緣或用裝置本身的夾子固定。帶凹口的玻璃板應面對緩沖液槽向里面放置。

13.? 用配制凝膠溶液同一批次的 5 × TBE 配制電泳緩沖液灌滿緩沖液槽。用一根彎頭巴斯德吸管或注射針頭排除藏匿于凝膠底部的氣泡。

14.? 用巴斯德吸管或注射器再次吸取 1 × TBE 沖洗加樣孔。將 DNA 樣品與適量 6 ×凝膠載樣緩沖液混合，用 Hamilton 注射器或帶有拉長的塑料吸頭的微量移液管加入加樣孔。

15.? 將電極與電源相連（正極接下槽），打開電源，進行電泳。

16.? 電泳至標準參照染料遷移至所需位置。關閉電源，拔掉插頭，棄去電泳槽中的電泳緩沖液。

17.? 卸下玻璃板，用解剖刀或剃須刀片除去凝膠密封膠帶。將玻璃板放在實驗臺上（硅化的玻璃板在上面）。用間隔片或塑料楔將上面的玻璃板的一角翹起。檢查一下凝膠仍應附著在下面玻璃板上。將上面的玻璃板平穩的移開，去掉間隔片。

18.? 用染色檢測或放射自顯影檢測檢測聚丙烯酰胺凝膠中的 DNA 條帶的位置。

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