?

（一）概述 基因診斷是以核酸分子雜交技術為基礎，在核酸水平檢測人類遺傳性疾病的基因缺陷和一些傳染病病原體的方法。其基本過程是：制備探針，標記探針，檢測樣本。開展這項工作的關鍵是要得到高靈敏度、高特異性的探針。以往人們是用放射性同位素來標記探針。近年來，非同位素標記方法發展很快，已有取代同位素標記法的趨勢。地高辛配基隨機標記探針法，是較為成功的一種非同位素標記方法。其原理是：用化學方法把類固醇類半抗原地高辛分子連接在dUTP上（Dig-dUTP）。用隨機引物及多聚酶，以探針為模板，合成互補，化學修飾過的dUTP同時摻入到標記的探針中。雜交后用堿性磷酸酶標記的抗地高辛單抗與標記探針中的Dig-dUTP結合，加入顯色底物，在堿性磷酸酶作用下，轉變成深棕色或藍色的化合物。 1、標記：本試劑盒采用隨機引物標記方法，可標記少至10ng，多至3μg的。能在新合成的鏈每20～25個核苷酸，摻入一個Dig-dUTP，反應時間約為1h。 2、雜交：按標準雜交方法進行。可以采用尼龍膜或硝酸纖維素膜。用過的雜交液可凍存于-20℃，重復使用。 3、免疫學檢測：封阻后，檢測反應的第一步，抗體結合物與標記結合，出現雜交的半抗原-標記，顯色反應起始是在堿性pH條件下加入無色的顯色劑X-磷酸鹽和NBT，在幾分鐘內便開始出現藍色，顯色反應的過程持續3d。典型的例子是在24h后終止顯色反應。用二甲基甲酰胺洗掉尼龍膜上的顏色后，尼龍膜可重新用于雜交。 4、應用：地高辛配基標記探針及檢測試劑盒，能檢測0.1pg的同源，能檢測1μg哺乳動物DAN中的單拷貝基因，與放射性標記系統比較，此試劑盒能快速得到實驗結果（從的標記和雜交至見到檢測結果24h內能完成），而且消除了放射性的不安全問題。這試劑的靈敏度與特異性使它適用于所有的雜交技術（包括 -印跡轉移，菌落雜交，噬菌斑雜交及原位雜交）以替代同位素標記和放射自顯影術。 （二）試劑盒成份 1、無標記對照1：此管內有20μl pBR328 100μg/ml,pBR328分別用BamHⅠ,BglⅠt HinfⅠ消化，它們的混合比例為2：3：3，共有16個Pbr328片段，這些片段的大小分別為：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298，234，234，220和154×2bp。 2、無標記對照2：此管內有20μl pBR328 200μg/ml，已用EcoRⅠ線性化。 3、稀釋緩沖液：有兩管，每管1ml[成分為：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]內含鮭魚精（50μg/ml）。 4、標記對照：此管內有50μl線性化pBR328 ，按標記方法已標記有地高辛配基dUTP,含20μg模板，每毫升含5μg合成的標記。 5、六聚核苷酸混合物 6、標記用混合底物：此管內有50μl 10倍濃度的dNTP標記用混合底物，含dATP（1mmol/L）dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)。 7、聚合酶Ⅰ大片段（標記級）：此管內有25μl 聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2U /μl。 8、（Dig）AP結合物：此管內有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，結合有堿性磷酸酶750U/ml。 9、NBT：有兩管，每管1.25ml，是溶于70%（V/V）二甲基甲酰胺的硝基藍四唑鹽溶液（75mg/ml）。 10、X-磷酸鹽：有兩管，每管0.9ml，是溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽的甲苯胺溶液（50mg/ml）。 11、封阻試劑：有兩瓶，每瓶有50g粉劑。 （三）需配制的溶液 EDTA（0.2mol/L）,pH8.0 (20℃);LiCl(4mol/L);70%(V/V)乙醇；Tris-HCl(10mmol/L);ED－TA(1mmol/L),pH8.0(20℃);10%(V/V)N-十二烷基肌氨酸鈉鹽；10%（V/V）SDS；20×SSC：3mol/l NaCl;0.3mol/L檸檬酸三鈉；pH7.0 Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L);pH7.5Tris –HCl(100mmol/L);NaCl(100mmol/L);MgCl2(50mmol/L)pH9.5(20℃)。

（四）操作方法 1、標記探針　每次標準的反應可標記10ng至3μg線性的，也可標記更大量的，但所有的成分和體積要相應增加。 （1）探針熱變性，煮沸10min，迅速冷卻于冰/乙醇中5min以上，待用。 （2）取Eppendorf管（1.5ml）置于冰上，加下列及試劑： 新鮮變性的 　　　　　　　　　　???? 1-3μg ????? 六聚核苷酸混合物 　　　　　　　　 2μl（管5） ????? dNTP標記用混合底物 　　　　　　　2μl（管6） ????? 加無菌重蒸水至　　　　　　　　　?? 19μl ????? 聚合酶Ⅰ大片段（Klenow）　　　??? 1μl（管7） （3）在37℃保溫至少60min，可到20h。 （4）煮沸5min，終止反應。 （5）15000rpm離心30s，置于冰上待用。 2、預雜交　按100cm2 膜用20～40ml預雜交溶液，預雜交時使溶液處于流動狀態。 預雜交液組成：5×SSC ????? 0.5%（W/V）封阻試劑（管11） ????? 0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉 ????? 0.02%（W/V）SDS ????? 膜放入塑料袋，灌入預雜交液，排除氣體后密封，在65℃預雜交過夜。 3、雜交　按100cm2膜用2.5ml雜交液，雜交時偶爾搖動雜交袋，使里面的溶液重新分配。 雜交液組成： 50%甲酰胺（V/V） ????? 5%（W/V）封阻試劑 ????? 5×SSC ????? 0.1（W/V）N-十二烷酰肌氨酸鈉 ????? 0．02%(W/V)SDS ????? 新變性標記（150ng/ml） ????? 雜交液取代預雜交液，替換間膜不能干，成功地替換應是膜與塑料袋間形成一層雜交液膜。于42℃雜交過夜（16～20h）。 4．洗膜　　按100cm2 膜用250ml洗膜液計算。 （1）在室溫下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。 （2）在65℃條件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，10min，2次。 （3）在室溫下用2×SSC溶液漂洗1次。 5．免疫測定 （1）配制溶液 緩沖液1：Tris-HCl(100mmol/L);NaCl(150mmol/L)pH7.5(20℃） 緩沖液2：0.5%(W/V)封阻試劑(管11),配制于緩沖液1中(封阻試劑不會快速溶解,因此應預早1h前配制此溶液,將試劑溶于50～70℃,此溶液保持混濁)。 緩沖液3：Tris-HCI(100mmol/L);NaCI(100mmol/L);MgCI2 (500mmol/L)pH9.5(20℃)。 緩沖液4：Tris-HCl(10mmol/l);EDTA(1mmol/L);pH8.0(20℃) 顯色溶液：新鮮配制，在10ml緩沖液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸鹽緩沖液（管10）。 （2）顯色過程 A、膜在緩沖液1中短暫洗滌（1min）。 B、在100ml緩沖2中保溫30min。 C、再用緩沖液1短暫洗滌。 D、用緩沖液1稀釋的抗體結合物(管8)至150U /L(1:5000);稀釋后的抗體結合物在4℃只能穩定12h。 E、膜在20ml稀釋的抗體結合物溶液中保溫30min。 F、用100ml緩沖液1洗膜,以除去未結合的抗體結合物,15min,2次。 G、膜在緩沖液3中平衡2min。 H、在黑暗條件下,膜與10ml顯色溶液放入塑料袋內密封或放入合適的盒子內,幾分鐘內開始出現顏色,一般顯色反應在1天后全部完成。當顏色顯影時，不可振蕩或攪拌。 I、當要求的點或帶已被檢測時，可用50ml緩沖液4洗膜5min終止反應。 J、攝相。 說明：上述各反應均在室溫下進行，除了顯色反應外，均需振蕩或攪拌。