3 植物總DNA 的提取 ??? 1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分離了植物DNA，然而這些DNA 是不能用于克隆的。在發明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人們可用分離動物組織DNA 的方法分離植物DNA。去除植物帶電高分子污染物的方法有核分離（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）分離（Murray，Thompson 1980）和鹽酸／十二烷基肌氨酸鈉分離（Sung，Slightom 1981）等。在這些方法中，CTAB 方法因簡便、快速而使用最廣泛。收集和保存植物組織的方法對于 DNA 的產量和質量也有很大影響。雖然已能成功地從植物標本和化石中分離出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鮮材料能產生最好的結果，特別是對于產生大量單寧、酚或其他次級代謝產物的種。如材料不能馬上進行提取，應保存在冷而濕的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷凍保存。如果沒有條件，最好在無水CaSO４ 瓶中快速干燥（Liston 等 1990）。DNA 的提取應盡快進行，以防其降解（Pyle，Adams1989）。 ??? 提取DNA 的過程中有許多因素能導致DNA 降解。首先是物理因素。因為DNA 分子量較大，機械張力或高溫很容易使DNA 分子發生斷裂。因此，在實際操作過程中應盡可能輕緩，盡量避免過多的溶液轉移及劇烈的振蕩等，以減少機械張力對DNA 的損傷，同時也應避免過高的溫度。其次，細胞內源DNA 酶及細胞破裂釋放的次級產物也會導致DNA 降解。所以在提取DNA 的實驗中，設計了許多可供選擇的分離緩沖液，以適應不同的植物材料。分離緩沖液的pH 值有時需要進行改進，pH 應避免接近降解酶的最適點。大多數降解酶和脂肪氧合酶pH 值的最適點在 5．0～6．0 之間，而DNA 酶pH 值最適點在 7．0 左右（Dunham，Bryant 1963）。由于在過酸的條件下，DNA 脫嘌呤會導致DNA 的不穩定，極易在堿基脫落的地方發生斷裂，所以大多植物DNA 提取緩沖液的pH 值為8．0，有的甚至為9．0。緩沖液中包含了大量的復合物，如 EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、牛血清白蛋白（BSA）、β-巰基乙醇、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇（DTT）、抗壞血酸（Vc）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二乙基焦碳酸鹽（DEPC）、溴化乙錠（EB）等（Hallick等1977）。但由于上述物質有些是抑制內切酶和非特異性核酸酶的，所以在其后的步驟中要將其除去。分離DNA 與蛋白質一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿對蛋白質均有極強的變性作用，而對DNA 無影響。下面的方法描述DNA 與污染物多糖的分離，也可用陰離子交換層析儀來進行。下面列出了3 種常見的分離植物總DNA 的方法。3 種方法溶解細胞膜和分離蛋白質的方法不同，各有其優、缺點。 ?3．1 CTAB 緩沖液方法 ??? 這是最廣泛地用來分離植物DNA 的方法，對大多數植物種都適用，特別是當樣本數量很小時。此法運用陽離子去污劑CTAB 溶解植物細胞膜，并與DNA 形成一復合物。其優點是不需要準備大量的植物組織，而且適合像葉、根、種子、胚、胚乳、花粉和懸浮培養的組織等多種類型的組織（Rogers，Bendch 1985）。另外，此法對樣品數量的要求也不高，從小到毫克數量的標本（木乃伊、化石）到許多克的新鮮材料均可使用（Golenberg 等 1990；Rogers Bendch 1985）。 ?3．1．1 CTAB 的實驗方法 1．材料 （1）2 倍CTAB 緩沖液： 100 mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值 8．0 1．4mol／dm３ NaCI 20 mmol／dm３ EDTA 2％ CTAB（W／V） 1％ PVP-360（W／V） 0．2％?-巰基乙醇（體積比，用前在通風櫥中加） （2）清洗緩沖液： 76％乙醇 10 mmol／dm３乙酸銨 （3）懸浮緩沖液： 10 mmol／dm３乙酸銨 0．25 mmol／dm３EDTA，pH 值 8．?2．步驟 （1）加熱分離緩沖液、研缽、研杵到60℃。 （2）在熱研缽中放人0．5～1．5g 新鮮或冰凍的葉子，用7．5ml 2 倍CTAB 分離緩沖液研磨（可加些石英砂幫助研磨）。對凍干的組織用1 倍CTAB 緩沖液研磨。把研碎的組織倒入50ml 管中，再用0．5ml 2 倍CTAB 緩沖液沖洗研缽，將沖洗液加到管中。 （3）將試管在60℃下放置30～60 分鐘，然后輕輕振蕩，使之充分混合后降至室溫。 （4）在試管中加入10ml 氯仿－異戊醇（24:1）萃取液（如顏色深可再進行一次），輕輕搖晃使其混合，在室溫下1500r／min 離心5 分鐘，使其分相。 （5）將上層的水相倒入－15ml 管中，加2／3 體積的冷異丙醇，輕輕混合以沉淀核酸。如果看不到核酸沉淀，可在－20℃下放置20 分鐘或更長時間。 （6）室溫下 800r／min 離心 3～5 分鐘，如果看不到小團或沉淀，可在－20℃下放置 20分鐘再離心。 （7）小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，這時的核酸一般松散地貼在管的底部，加 15ml清洗緩沖液，輕輕地旋轉清洗沉淀物，15～20 分鐘后核酸將變得更白。 （8）室溫下800r／min 離心5 分鐘（如不充分，則加大離心速度或延長離心時間），倒掉清洗緩沖液，將管倒扣在紙巾上，讓沉淀物干燥，小心不要讓DNA 滑掉。 （9）按沉淀物的大小用少量懸浮緩沖液（10～100 μl）懸浮DNA。 （l0）用100μg／ml RNAase 在 37℃下溫育 30～60 分鐘。 （11）如果組織包含單寧或其他次級產物，可以對 DNA 作進一步純化（可用氯仿、苯酚純化）。一些材料可能需要用氯銫（CsCl）梯度純化。上述方法也可以進行改進，像巰基乙醇的濃度可以提高至 25mmol／dm３，也可加入 l％的抗壞血酸、DTT 等，CTAB 也可用 SDS 取代（Golenberg 等1990），也可用 TE（10mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值 8.0，lmmol／dm３EDTA）作懸浮緩沖液。?3．1．2 CTAB 沉淀法 1．材料 2 倍CTAB 分離緩沖液；沉淀緩沖液： 100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；20 mmol／dm３EDTA；2％CTAB（w／V）。 2．步驟 （1）與7．3．1．1 中前4 個步驟同。 （2）吸取上層水相，將其例入一個15ml 管中。 （3）加 3 倍體積的沉淀緩沖液，使NaCI 的濃度減少到 0．35mol／dm３ ，室溫下放置 30分鐘。 （4）室溫下 2 000r／min 離心 5 分鐘，以沉淀 DNA。 （5）根據沉淀物的大小，用少量的懸浮緩沖液（10～100μl）懸浮DNA。 （6）雖然氯仿或苯酚提取DNA 是有效的，但是對那些包含單寧或其他次級產物的組織，可以在氯化銫梯度上進一步純化。 ?3．2 蛋白質沉淀方法 ??? 這個方法可以產生高質量的DNA，但產量也是最低的。一般在沉淀核酸之前用乙酸鉀沉 淀蛋白質和多糖（Dellaporta 等1983；Galau 等1988；Hughes，Galau 1988）。此方法不需要有機提取，而且快速，所以對大量樣品比較合適。 1．材料 ??? 提取緩沖液：100mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值8．0；50mmol／dm３EDTA，pH 值8．0；500mmol／dm３ NaCl；2％SDS（w／v）；l％PVP-360（w／v）；0．1％β-巰基乙醇（體積比），用之前在通風櫥中加。 2．步驟 （1）用液氮在研缽中研磨1．0g 新鮮葉子，可以加一些石英砂幫助研磨。將研磨完畢的粉末貯存在－80℃冰箱中，在加提取液之前，不要讓植物材料融化。 （2）在冰凍的組織中加 6ml 提取緩沖液，轉到一個15ml 的離心管中，充分振蕩大約30 秒鐘，使之混合均勻，然后在65℃下放置20 分鐘。 （3）往管中加入2ml 5mol／dm３ 乙酸鉀（pH 值6．5），充分搖勻，在冰水中放置5 分鐘。隨著不溶的十二烷基硫酸鉀的沉淀，大部分蛋白質和多糖作為復合物被除去了。 （4）在 4℃下 2 000r／min 離心 20 分鐘。 （5）吸出上清液，將其倒入一個干凈的 15ml 的離心管中，不要帶入顆粒物質，然后加 4ml 異丙醇輕輕混合，在－20℃下放置。 （6）在4℃下 2 000r／min 離心 15 秒鐘，DNA 沉淀后，輕輕地倒掉上清液，在紙巾上倒扣10 分鐘或更長時間，以干燥沉淀物。 （7）將沉淀物放在 100TE 中溶解，然后將溶液倒入一個1．sml 離心管中，離心 5分鐘，移去不溶的沉淀。 （8）將管中上清液倒入另一個 1．5ml 離心管中，加 75μl 3mol／dm３ NaAc（pH 值 7．6）和500μl 冷異丙醇，充分混合，在—20℃下放置1～2 小時，拿出后再在室溫下放10 秒鐘，使管中DNA 沉淀。 （9）用 500μl 80％乙醇洗沉淀物 10 分鐘，離心 1 分鐘，干燥沉淀物 10 分鐘。 （10）根據DNA 沉淀物的大小，用少量的 TE（10～100μl）溶解DNA。 ?3．3 氯化銫方法 ??? 這個方法的原理是根據在氯化銫（CsCl）中的不同密度梯度來分離細胞成分。此方法可以產生大量高純度的DNA，但費時，而且需昂貴的儀器設備，對需要復雜的有機提取或沉淀的材料比較適合（Carr，Griffith 1987；Weeks 等 1986）。在一些情況下，它可能是在含大量次級產物的植物中提取高質量DNA 的唯一方法。DNA 可以在一個平衡的CsCl 梯度中通過與以下幾個染料中的一個結合而被純化， 這幾個染料為溴化乙錠（ Ethidium bromide）、Bisbenzimicle、碘化丙錠（propidium iodide）、Bisbenzimide，它們不同的?3．4 PCR 小量制備法 ??? 此方法的優點是一次可以提純很多樣品，比較快速，而且小于10mg（50mm）的新鮮葉子材料就可以產生足夠的DNA，產生的DNA 對雜交實驗是可用的（Millgan 1992）。這個方法存在的問題是DNA 沉淀物可能不夠緊密，或不一定能形成一緊密的DNA 沉淀。 1. 材料 ??? 分離緩沖液：200 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；250 mmol／dm３ NaCI；25 mmol／dm３ EDTA； 0．5 ％ SDS。 2．步驟 （1）用1．5ml 離心管研磨小的組織樣品。可取管口大小的新鮮葉子（＜10mg），凍在液氮中 的葉子也可用。 （2）在研碎的樣品中加 400μl 的分離緩沖液，用適合的速度渦旋 10 秒鐘，以分散開樣品。 （3）在室溫下將1．5ml 離心管中樣品離心 12～15 分鐘，沉淀細胞內物質。 （4）搜集300μl 的上清液，棄去沉淀。 （5）在上清液中加300μl 預冷異丙醇，倒轉樣品1～3 次，使之充分混合，在室溫下至少放 置5 分鐘。 （6）將微離心管中的樣品在室溫下離心20 分鐘，以搜集沉淀的DNA。 （7）棄去上清液，用300μl 80％的乙醇室溫下沉淀 10 分鐘。 （8）室溫下離心樣品12 分鐘，棄去上清液。 （9）用300μl 80％的乙醇再洗后，室溫下離心 5 分鐘，棄去上清液。 （10）室溫下干燥樣品1 小時或將樣品放過夜。 （11）用 100μl TE 懸浮樣品。?相關鏈接：動植物樣品的采集及DNA樣品的提取（上）動植物樣品的采集及DNA樣品的提取（下）