一、地高辛（Dig）標記DNA探針在石蠟切片上的檢測方法

1. 組織切片的預處理

（1）固定：組織以10%中性福爾馬林液，常規石蠟包埋，切片厚4-6 μm，最好用硅化玻，60℃烤片6-8 h。

（2）脫蠟至酒精。

（3）入0.2 mmol/L HCl 20 min 去除蛋白。

（4）50℃2×SSC，含5 mmol/L EDTA溶液中30 min。

（5）蛋白酶K（1 μg/ml 溶于0.1 mol/L PBS中），37℃20-25 min。

（6）0.2 mol/L 甘氨酸液：室溫10 min，中止蛋白酶反應。

（7）4%多聚甲醛（PBS新鮮配制），室溫20 min。

（8）PBS/5 mmol/L MgCl2漂洗10 min×2。

（9）脫水，從低濃度到高濃度至無水乙醇，空氣中干燥。

2. 預雜交

加預雜交液20 μl/每張切片，42℃水浴半小時（封閉非特異性雜交位點）。

3. 雜交

加雜交液20 μl/每張切片，加蓋硅化蓋片，將切片置于95℃10 min，使探針變性，DNA雙鏈解成單鏈，然后迅速置于冰上1 min，再將切片置于盛有2×SSC濕盒內，37-42℃過夜（16-18 h）。有條件也可用原位雜交儀進行變性和雜交。 4. 雜交后漂洗

（1）2×SSC液內振動移除蓋片。

（2）2×SSC55℃5 min×2。

（3）0.5×SSC50℃5 min×2。

（4）緩沖液Ⅱ（含0.5%封阻試劑，用緩沖液Ⅰ溶解）37℃30 min。

（5）緩沖液Ⅰ（100 mmol/L Tris-HCl，15.0 mmol/L NaCl pH7.5）15 min，室溫。

（6）酶標地高辛抗體（1∶5000，用緩沖液Ⅰ稀釋）37℃30 min。

（7）緩沖液Ⅰ15 min×2，室溫。

（8）緩沖液Ⅲ（100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，50 mmol/L MgCl2，pH9.5）室溫，2 min。

5. NBT/BCIP顯色，顯微鏡下進行觀察。水洗，核固紅復染，脫水封片。

6. 結果

雜交陽性信號呈紫蘭色，細胞核呈紅。

二、生物素標記DNA探針在石蠟切片上的檢測方法。

（1）固定：組織以10%中性福爾馬林液，常規石蠟包埋，切片厚4-6 μm，最好用硅化玻，60℃烤片6-8 h。

（2）脫蠟至酒精，空氣中干燥。

（3）蛋白酶K（1 μg/ml 溶于0.1 mol/L PBS中），37℃20-25 min。

（4）PBS漂洗5 min×2。

（5）脫水，從低濃度到高濃度至無水乙醇，空氣中干燥。

雜交反應

（1）變性和雜交

加雜交液20μl/每張切片，加蓋硅化蓋片，將切片置于95℃10 min，使探針變性，DNA雙鏈解成單鏈，然后迅速置于冰上1min，再將切片置于盛有2×SSC濕盒內，37-42℃過夜（16-18 h）。有條件也可用原位雜交儀進行變性和雜交。 （2）雜交后漂洗

①將雜交玻片從濕盒（或雜交儀）中取出，用2×SSC將蓋玻片洗脫

②用2×SSC30℃洗2次，每次5 min

③用1×SSC42℃洗2次，每次5 min

④TBS緩沖液洗2次。

注意在漂洗過程中切片不能干燥。

（3）雜交信號的檢測

與免疫組化方法類似，現在大多數的研究都是采用堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶與抗半抗原抗體（或抗生物素蛋白）連接進行檢測。

①在切片組織上滴加堿性磷酸酶標記的鏈菌素溶液，室溫孵育20-40 min

②TBS緩沖液洗3次×5 min

③滴加BCIP/NBT，室溫暗處顯色10-30 min，TBS緩沖液洗

④0.1%核固紅復染1 min，蒸餾水沖洗

⑤酒精脫水，中性樹膠封片。

（4）雜交結果

DNA原位核酸分子雜交陽性反應為靶基因存在的部位，一般在細胞核內，呈紫藍色顆粒狀，陰性細胞核呈紅色。