摘要

骨髓間充質干細胞（MSC）為組織工程學和再生醫學帶來重大希望。臨床及臨床前對MSC的應用需要它們在培養基中以最大效率擴增，并且維持分化為主要細胞系的能力。胎牛血清（FBS）是一種體外維持hMSC生長的要素，但是批次之間的差異能明顯影響實驗結果。

為了制造能始終如一地使hMSC最優擴增的生長培養基，我們測試了幾種來源的FBS的不同濃度。

我們的結果表明FBS樣品間的擴增效率差異很大，一次傳代后可擴增1.8至4.2倍。使hMSC最大擴增的FBS批次用于開發StemXVivoTM骨髓間充質干細胞擴增培養基。

與另一種市上MSC擴增培養基作比較測驗，用StemXVivo骨髓間充質干細胞擴增培養基傳2代后可以擴增5.6倍，相比之下，競爭者的培養基只擴增2.8倍。然后，我們力圖證實在StemXVivo骨髓間充質干細胞擴增培養基中擴增的細胞保有全部的分化潛能。

我們分析了擴增后的細胞表型，發現它們是CD105+，CD90+和CD34-。我測試它們分化為軟骨細胞，骨細胞和脂肪細胞的能力。種系特異的抗體染色證明了這些細胞可以有效地分化為軟骨細胞，骨細胞和脂肪細胞。

因此，我們表明通過對幾批FBS的提前篩選而制造的擴增培養基具有最大MSC擴增效率，而且不會損害MSC的多能性。

引言

骨髓間充質干細胞或者骨髓基質細胞（MSCs）是具有多種系潛能的成人干細胞，它們便于基因改造并且具有免疫抑制能力。它們用途廣泛，為組織工程學，再生醫學和免疫療法帶來希望。包括骨髓，骨膜，骨小梁，脂肪組織，滑膜，骨骼肌和乳牙在內的許多組織都有MSCs。

它們能分化為骨，軟骨，肌肉，骨髓，腱，脂肪和結締組織。懷著對在體和體外實驗深入研究的希望，我們有興趣優化培養和擴增MSC的培養條件，同時保留MSC的多能性和分化能力。

為了評估不同來源和濃度的血清對MSC擴增的影響，我們用市上分化試劑盒和組分嚴格地測試了每種FBS對最大擴增潛能，維持hMSC表型特性和擴增的MSCs分化為脂肪細胞，骨細胞，軟骨細胞的影響。我們通過對FBS的篩選開發了StemXVivo人/小鼠骨髓間充質干細胞擴增培養基。

我們的研究強調利用為研究hMSCs而開發，優化和測試的市上產品的優點。

我們的研究強調使用商品化產品的優勢。為了hMSCs的研究，這些商品化的產品都已經被改善，優化，并且進行了檢測。

材料和方法

人MSC 的培養。人MSCs （hMSCs ） 購于Cambr e x （ Lonz a ,Walkersville），先根據供應商的說明書培養，然后用StemXVivo人/小鼠骨髓間充質干細胞擴增培養基（ 目錄# C C M 0 0 4 ； R & DSystems，Minneapolis）培養。

為了測試不同批次FBS的擴增潛能，每種F B S 以終濃度為1 0 % 或2 0 % 加入含有谷氨酰胺， 丙酮酸鈉（ I r v i n e S c i e n t i c ， S a n t a A n a ） 的α - M E M 培養基（Invitrogen，Carlsbad）。

將1.25×105量級的hMSCs接種于一個T75長頸瓶，在細胞匯聚之前讓細胞生長3至4天。在培養期末，培養于不同條件的hMSCs同時用胰蛋白酶/EDTA溶液收集。對細胞計數，并且用下面的公式計算擴增倍數。重新培養時，將1.25×105量級的hMSCs接種于一個新的T75長頸瓶，并用適當的培養基培養。每次傳代后對細胞進行計數。

抗體。藻紅蛋白（PE）連接的小鼠抗人CD90和CD105的單克隆抗體（mAbs），PE非連接的山羊抗小鼠FABP-4多克隆抗體，PE非連接的小鼠抗人骨鈣蛋白單克隆抗體，PE非連接的山羊抗人聚蛋白多糖多克隆抗體，PE連接和非連接的同型對照，NorthernLights-557連接的驢抗山羊和驢抗小鼠的二抗都采購于R&D Systems。PE連接的小鼠抗人CD34單克隆抗體源于BD Pharmingen（BD Biosciences，San Jose）。

流式細胞術。hMSCs的收集如上所述。細胞用2×冷FACS緩沖液沖洗（含有2%FBS和疊氮化鈉的PBS），然后以每毫升106量級細胞的密度重新懸浮于FACS緩沖液中。

2至8℃下，1×105量級的hMSCs用PE連接的單克隆抗體或者同型對照孵育45分鐘。被染的細胞用2×冰冷FACS清洗，然后用FACSCalibur（BD Biosciences, SanJose）獲取數據，用CellQuest軟件（BD Biosciences）分析數據。

免疫細胞化學。人骨髓間充質干細胞功能鑒定試劑盒（ 目錄#SC006, R&D Systems）的內單上有詳細步驟。簡而言之，室溫下用含有4%多聚甲醛的PBS固定培養于蓋玻片上的細胞20分鐘，然后室溫下用含有10%標準驢血清，0.3%Triton X-100和1%BSA的PBS封閉45分鐘。

封閉后，在2至8℃下用稀釋的一抗孵育細胞過夜，然后在室溫下的暗室中用NorthernLights-557連接的二抗孵育細胞一個小時。每一個步驟間，細胞用含有0.1%BSA的PBS清洗三次。

成脂分化。按人骨髓間充質干細胞功能鑒定試劑盒的說明書誘導hMSC分化為脂肪細胞，骨細胞或軟骨細胞。簡而言之，準備完全成脂分化培養基和帶有無菌蓋玻片的24孔組織培養皿，將5 mL α-MEM基礎培養基中3.7×105量級的hMSCs植入培養皿的十個孔中。

37℃下，培養皿在含有5% CO2的增濕孵化器中孵育，第二天細胞會匯合，棄掉培養基，然后加入0.5 mL的成脂分化培養基。每3至4天更換一次分化培養基，7天后脂肪細胞可見。第21天固定脂肪細胞，然后用免疫細胞化學技術鑒定。

成骨分化。用StemXVivo人/小鼠成骨基礎培養基（目錄#CCM007；R&D Systems）和StemXVivo人成骨補充劑（目錄#CCM008；R&DSystems）誘導hMSCs分化為骨細胞。將0.5 mL完全成骨基礎培養基中7.4×103量級的hMSCs植入含有無菌蓋玻片的24孔培養皿的每個孔中。

37℃下，培養皿在含有5% CO2的增濕孵化器中孵育1至2天，直至50%至70%的細胞匯合，然后用0.5 mL的完全成骨分化培養基替換每個孔中的培養基。每3至4天更換一次分化培養基，14天至21天期間骨細胞可見。用免疫細胞化學技術鑒定分化的骨細胞。

成軟骨分化。用S temX Vi v o 人/ 小鼠成軟骨基礎培養基（ 目錄#CCM005；R&D Sys tems）和StemXVivo人成軟骨補充劑（目

錄#CCM006；R&D Systems）誘導軟骨細胞分化。

簡而言之，將2.5×105量級的hMSCs移入一個含有5 mL預熱完全成軟骨基礎培養基的15 mL錐形管中，然后200×g離心5分鐘。將hMSCs重懸于0.5 mL預熱的完全成軟骨分化培養基中，然后200×g離心5分鐘。

不破壞管底形成的細胞團，旋松錐形管的蓋子讓氣體交換，然后37℃下，在含有5% CO2的增濕孵化器中直立孵育。每2至3天更換一次分化培養基，14天至21天后收獲軟骨細胞團。對軟骨細胞團進行固定，切片，然后用免疫細胞化學技術分析。

結論

1. 通過對FBS的來源，批次和濃度的嚴格檢測，我們鑒定一系列MSC培養基的效果。我們利用這些數據開發了人/小鼠StemXVivo骨髓間充質干細胞擴增培養基，該培養基優于其他市上擴增培養基。

a．對比于領先的競爭者的擴增培養基，StemXVivo骨髓間充質干細胞擴增培養基使hMSC更高倍地擴增。

b．用StemXVivo骨髓間充質干細胞擴增培養基培養擴增的hMSCs保有MSC表型，表現為具有關鍵的MSC標識物CD105和CD90，并且沒有CD34。

c．擴增的hMSCs保有成脂分化，成骨分化和成軟骨分化的全部潛能。

2. 結合我們用于MSC分化的培養基和試劑，StemXVivo骨髓間充質干細胞擴增培養基提供了一個完整的研究生產線，它可以促進對hMSC，脂肪形成，骨形成和軟骨形成的研究。

關于R&D Systems

R&DSystems總公司于1976年成立于美國，在美國NASDAQ上市(TECH)。公司一直致力于各種細胞因子及其相關分子的生產研發。R&D Systems產品覆蓋面廣，種類豐富，質量穩定可靠，其生產的各種ELISA試劑盒、重組因子及抗體以其卓越的品質贏得了世界各國科研及臨床診斷機構的青睞。