下面的操作方法可以使約3~5分子的生物素與1分子的蛋白結合，對某些蛋白來說，生物素與蛋白的分子比可根據不同的生物素化要求進行調整。

　　1. 溶解2~10 mg 蛋白于1 ml 的BuphTm磷酸鹽緩沖液中，并計算溶解的毫摩爾數。如果蛋白含有不恰當的緩沖液（如Tris或者甘氨酸），可以通過在PBS中透析或濃縮的方法除去。計算：蛋白質量（mg）/蛋白分子量（MW）＝蛋白質的毫摩爾數。

　　2. 在打開之前，平衡生物素至室溫。加2 mg Sulfo-NHS-Biotin于100 ul 超純水中，加入足夠量濃度的生物素，一般對于10 mg/ml 蛋白來說超過12倍分子數，對于2 mg/ml 蛋白溶液應超過20倍，或者該試劑也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中

　　3. 室溫30分鐘，或冰上放置2小時。

　　4. 用30 ml PBS預洗純化柱，上樣，加入與欲收集量相同的緩沖液，收集0.5 ml 或1 ml 于單獨的管中。

　　5. 以280 nm 的吸收值測定蛋白含量。

　　6. 生物素化的蛋白4℃存放至使用，可加入疊氮鈉、甘油等保存。

　　HABA法檢測生物素標記效果

　　試劑配制：

　　1. PBS（100 mM 磷酸鹽，150 mM Nacl

　　pH7.2）

　　2. HABA/親和素溶液：10 mg 親和素、600 ul10 mM

　　HABA于19.4 ml 的PBS中，該溶液的A500大約在0.9~1.3之間，溶液于4℃保存可穩定2周。如果有沉淀形成（HABA溶液）可過濾后使用。

　　比色法檢測生物素/蛋白質摩爾質量比：

　　1. 吸取900 ul

　　HABA/親和素溶液于1ml比色杯。

　　2. 測定該溶液在500 nm 處的吸收值并記錄為“A500

　　HABA/Avidin”。

　　3. 吸取100 ul 生物素標記的蛋白于杯中并測定500 nm 的吸光度值，記為A500

　　HABA/Avidin/Biotin （數值必須恒定15s 以上）如果A500

　　HABA/Avidin/Biotin的值不超過（≤）0.3，重新稀釋待測樣品并檢測。

　　注：計算結果時必須考慮稀釋度。

　　4. 計算Biotin/Protein摩爾比

　　①A=生物素化的蛋白毫摩爾濃度＝蛋白濃度（mg/ml）/蛋白的分子量

　　②B=500nm處的吸光度變化

　　△A500=（0.9×A500HABA/Avidin）-A500HABA/Avidin/Biotin

　　③C=生物素的毫摩爾濃度=mmol Biotin/ml反應溶液=△A500/（34,000×光程）

　　④Biotin/Protein摩爾比=C?10?稀釋倍數/