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第四節　胃腸道粘膜T淋巴細胞

一、T淋巴細胞分布及其特點

胃腸道T淋巴細胞分布在上皮層、固有層、粘膜集合和散在淋巴濾泡及腸系膜淋巴結內。隨著免疫細胞化學技術廣泛應用和各類T細胞亞群單克隆抗體的制備成功，為進一步研究不同部位T淋巴細胞的分類和功能起極其重要的作用。

　　1．上皮內T淋巴細胞上皮內淋巴細胞（intraepithelial lymphocyte, IEL）是指位于上皮層基底部的T淋巴細胞。近年來，對IEL對鄰近上皮細胞有壓跡，位于兩個上皮細胞交界處，并未進入上皮細胞內。近年來，對IEL研究非常深入。已經證實75%以上成人小腸IEL是TCRγαβ陽性細胞，說明它們來源于胸腺，接受過抗原刺激。其中大部分為誘導、殺傷性T淋巴細胞（CD 8 或OKT 8 陽性），10%左右為CD 7 陽性和CD 3 陰性的IEL，類似NK細胞，有細胞毒作用，但無NK細胞標記，對NK的靶細胞無破壞作用。10%～20%左右為TCRδ陽性IEL，不受胸腺的影響，其中70%CD 4 和CD 8 均陰性，為T淋巴細胞前體。說明人的部分IEL通過胸腺外途徑進行分化。內毒素等腔內抗原與腸上皮細胞微絨毛、腸腺隱窩細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞膜上的組織相關性抗原分子（鼠為MHL-II，人為HLA-DR、HLA-DP和HAL-DR）相結合后，將抗原分子傳遞到CD 3 陽性T淋巴細胞受體（t lymphocyte receptor, TCR）中的α和β亞單位可變區進行結合，在CD 8 分子作用下導致IEL增殖和分泌大量γ-干擾素（γ-INF），α-腫瘤壞死因子（α-TNF），和少量的白介素-2（IL-2），發揮細胞毒性作用，調節　上皮細胞再生和增強對食物抗原的耐受。

　　2．固有層T淋巴細胞固有層T淋巴細胞（lamina propria lyphocyte, LPL）分散在固有層，約占固有層免疫細胞總數10%左右。其中CD 4 陽性細胞（CD 4 LPL）顯著多于CD 8 陽性細胞（CD 8 LPL）。40%CD 4 LPL表達CD 45 RO抗原，能產生大量IL-2、IL-4和γ-INF，為記憶性T淋巴細胞，能輔助B細胞轉化成抗體產生細胞并促其分泌抗體。60%CD 4 LPL表達CD 45 RA和CD 8 抗原，能直接抑制抗體產生細胞轉化和分泌。這兩種細胞的比例在調節　抗體分泌中起著重要作用。CD 8 LPL也可以分兩種：一種表達CD 28 抗原的LPL，能通過ADCC或直接溶解靶細胞。另一種表達CD 16 抗原，具有自然殺傷功能。LPL能被IL-2激活，激活的LPL能釋放大量IL-2、IL-4、γ-INF和IL-5、IL-2又能激活LPL，起著自身分泌作用。IL-5能促進抗體產生細胞分泌抗體。

　　3．胃腸道相關淋巴組織T淋巴細胞胃腸道相關淋巴樣組織（gut ? associated lymphoid tissue, GALT）主要包括腸系膜淋巴結和粘膜中集合和散在淋巴濾泡。GALTT淋巴細胞多們于生發中心的外周部位，約占40%。其中CD 8 和CD 4 陽細胞比例與周圍血相似。動物研究證明，腸系膜淋巴結內的CD 4 陽民生細胞多于固有層。分子生物學研究發現GALTT淋巴細胞含有IL-4和IL-5基因，激活后產生大量IL-4和IL-5，能特異性增加B和T淋巴細胞增殖。抑制B淋巴細胞分化。其表面糖蛋白主要為CD 45 RA和leu 8 (CD 8 )，證明是幼稚T淋巴細胞。它們對抗原刺激的增殖反應低，對刀豆素A等有絲分裂促進劑的增殖反應高，產生IL-2和γ-INF低，輔助作用弱。GALTT淋巴細胞如何調節　B淋巴細胞轉化成IgA產生細胞和其它免疫細胞的增殖及功能，并不十分清楚。有待進一步研究。

近年研究發現，除M細胞和巨噬細胞外，胃腸上皮細胞在接受和傳遞抗原中也起重要作用。免疫細胞化學發現正常小腸上皮細胞微絨毛和側膜有斑片狀MHc II類抗原，人小腸為HLA-DR糖蛋白，能識別、加工和傳遞抗原使粘膜內T淋巴細胞產生免疫反應。HLA-DR表達受γ-IFN誘導。因此免疫反應中組織相關性抗原與IEL和LPL淋巴細胞互相進行調節　。

二、研究方法

1．組織切片中T淋巴細胞80年代以前多用玫瑰花瓣試驗和酸性酯酶方法進行組織切片中T淋巴細胞研究，特異性較差。近年來多用OKT，Leu或CD等系列T淋巴細胞單克隆抗體進行研究，特異性高，可以分類出各種亞群。免疫組化染色中應注意以下幾個方面：

　　（1）抗體的選擇：根據不同目的選擇相應的抗體，如要對人胃腸道組織進行研究，可選用OKT系統單抗；對鼠類等進行研究可選用Leu 或Thy系列。如要研究輔助性T淋巴細胞可用OKT 4 或CD 4 ；研究抑制性T淋巴細胞可用OKT 8 或CD 8 等單克隆抗體。

　　（2）組織加工方法選擇：目前所研究的特異性T淋巴細胞抗原決定簇多位于細胞膜上，用陳舊或普通組織固定和加工方法可能使抗原破壞，應采用新鮮組織和低溫處理。具體方法是：手術或活檢獲得的組織立即用液氮冷凍，或用OCT復合物包埋后再放入液氮中，便于切片，Cryostat冰凍切片后室溫下風干，用4 ℃ 純乙醇或丙酮固定10min，PBS沖洗后即可進行免疫細胞化學染色。

（3）染色方法的選擇：因抗原較微量，而且位于細胞膜，應采取敏感性強、特異性高、非特異性著色少的方法。雖然有報道采用間接熒光或間接酶標技術也能顯示特異性T淋巴細胞，我們推薦最好采用PAP或ABC染色技術。具體方法參閱第三，四章　。

2．粘膜分離液中T淋巴細胞一定重量粘膜組織中分離出來的T淋巴細胞也可以用免疫細胞化學進行定量和定性研究。下面介紹用間接免疫熒光技術研究IEL的大致過程：

（1）將手術取得的腸管縱形剪開，將上皮層與固有層分離。

（2）上皮層放在無鎂離子、含100U青霉素和鏈霉素及0.2%疊氮納的PB中清洗，無血液和其它雜質后用解剖剪將組織剪碎，用勻漿器磨碎或用超聲粉碎或用膠原酶溶解上皮細胞。

（3）勻漿液通過脫脂棉、尼龍篩（只允許淋巴細胞濾過，除去粘液、碎屑和上皮細胞凝集塊）或金屬網（200目）獲得淋巴細胞懸液。

　　（4）將硅化玻璃球高壓消毒，沖洗和平衡后將懸浮液過柱，得到的細胞液直接計數。也可以用淋巴細胞分離液提取，用臺盼藍測定其活性，并加10%FCS-RPMI 細胞培養 液，淋巴細胞數應達5×10 6 /ml。

（5）試管內加0.1ml細胞液后加OKT系列單抗0.1ml，同時用另一試管加0.1mlPBS作對照。混合液在4℃放置30～60min（也可以在冰箱過夜）后，PBS（含RPMI）沖洗3次，離心后細胞沉淀物再加PBS至0.1ml。

（6）加0.1mlFITC標記的抗鼠IgG（根據工作效價），4℃放置20～30min，PBS洗3次，離心后加在紅細胞計數板上，熒光顯微鏡觀察。

（7）陽性細胞為細胞膜上有綠色熒光，有的呈顆粒樣，隨細胞滾動。熒光鏡下可計算200個淋巴細胞中陽性細胞所占的百分率，或根據血細胞計數板中陽性細胞算出細胞總數及百分率。

三、臨床意義

　　1．IEL在胃腸道粘膜中起重要免疫屏障作用正常成人空腸100個上皮細胞有20個IEL，回腸有13個，結腸只有5個，這也可能是惡性腫瘤不發生在小腸的重要因素之一。我們發現胃粘膜也有IEL。在胃部炎癥和潰瘍時，上皮及腺體隱窩細胞間的IEL明顯增加。IEL不但參與免疫反應，而且通過偽足與上皮細胞接觸，加速上皮細胞再生。電鏡下胃粘膜也發現這種現象。IEL與乳糜瀉（coeliac disease, CD）關系最密切。近期研究表明，第12型腺病毒與麥膠蛋白有同源性。CD病人腸道感染這種病毒后，服用麥膠數小時粘膜中IEL顯著增加。在上皮細胞HLAII抗原糖蛋白分子作用下與TCR結合，激活TCRαβlEL，發揮細胞毒作用，導致腸粘膜萎縮，引起脂肪吸收不良和腹瀉等一系列臨床癥狀。增加的TCRγδIEL調節　TCRαβ的殺傷作用。停服含麥膠食物后，TCRαβIEL明顯減少，上皮細胞再生恢復，臨床癥狀消失。CD病人出現疣狀胃炎也是IEL參與的免疫反應結果。CD病人的腸道淋巴瘤也是來自IEL增殖。器官移植后的宿主排異反應、結腸炎、熱帶性腹瀉、牛奶過敏和某些 自身免疫 性疾病均有IEL增加。也有人發現克隆氏病和潰瘍性結腸炎患者結腸IEL細胞毒性作用明顯減弱。當然，IEL增加是繼發或是原發，是否IEL是這些疾病的病因，臨床治療和診斷價值如何，還不清楚。而且IEL受年齡、抗原、免疫調節　劑（考的松對IEL無影響，環磷酰胺顯著降低IEL數量）等因素影響，因此需要深入進行研究。

2．粘膜固有層T淋巴細胞在局部體液免疫中起重要調節　作用在GALT中有開關性T淋巴細胞使生發中心的淋巴母細胞轉化成IgA產生細胞。這些細胞減少或功能缺乏可導致免疫球蛋白A缺乏。有人分離出克隆氏病和潰瘍性結腸炎病人固有層T淋巴細胞進行研究，發現輔助性T淋巴細胞減少，抑制性T淋巴細胞顯著增加，可能導致局部免疫失調，引起細胞毒性或遲發性過敏反應等，致使炎癥和潰瘍發生。

3．胃腸道腫瘤細胞中T淋巴細胞研究倍受重視我們及國內外一些報道均證明胃癌組織中T淋巴細胞顯著增加，且其細胞毒性大于非癌組織。胃癌病人周圍血T淋巴細胞毒性低于粘膜T淋巴細胞。但有人發現胃癌組織中T淋巴細胞的ADCC作用較弱。

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