（一）DNA的酶切與連接

　　（1）酶切反應

　　同質粒DNA的鑒定，只不過是質粒DNA換為載體DNA。若大量酶切，則成比例增加。

　　（2）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。

　　（3）15000rpm離心15min，棄上清。

　　（4）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。

　　（5）加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。

　　（6）測定DNA的含量。

　　（7）加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入DNA片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl，在12～14℃反應12～16h。

　　（8）連接反應液可置-20℃保存，供轉化用。

　　（9）關于待插入DNA片段的獲得參見附注。

（二）大腸桿菌感受態的制備及重組DNA的轉化

　　1．感受態的制備

　　（1）接種單菌落于2ml LB培養液中， 37℃過夜。

　　（2）取0.25ml過夜菌入25ml LB培養液中，37℃振搖4～6h至A590=0.4～0.6。

　　（3）倒入50ml管內，水浴10min，以2500～3000rpm離心5min，棄上清。

　　（4）緩慢加入75mmol/L預冷CaCl25ml懸浮菌體，冰浴20min，同上離心棄上清。

　　（5）緩慢加入75mmol/L預冷CaCl21.0ml輕輕混勻后分裝在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

　　2．重組DNA的轉化

　　（1）將3只Eppendorf管按下列轉化項目作好標記，然后按下述進行：

轉化項目受體菌DNA總體積DNA對照組010μl200μl受體菌對照組200μl0200μl轉化組190μl10μl200μl

????? （2）冰浴30min至1h。中間搖動3次，以防受體菌沉底。

　　（3）42℃90s。

　　（4）37℃水浴5min。

　　（5）加入無相應抗生素的Lb 200μl，混勻后，37℃水浴30～60min。

　　（6）分別取3組反應物各50μl在含相應抗生素的固體LB培養基平皿上涂布，室溫下干燥，然后倒置于37℃溫箱中培養過夜。

（三）轉化子DNA的快速鑒定－快速細胞破碎法

　　（1）挑取轉化平板上的單菌接種于含相應抗生素的2ml LB中，37℃振蕩培養至A590值為0.6～0.8。

　　（2）取1ml菌液至1.5ml Eppendorf管中，9000rpm離心9min，去盡上清。

　　（3）加入70μl Cracking Gel緩沖液[1mol/L Tris ?CHCl(pH6.8)10ml,20%SDS 10ml, 250mmol/L EDTA 1.6ml,蔗糖27.2g, 1.2%溴酚藍1.67ml，加雙蒸水至200ml]，混勻后，37℃水浴30min以上。

　　（4）15000rpm離心15min。

　　（5）吸取上清點樣電泳，觀察。

（四）轉化子DNA的酶切鑒定

　　1．轉化子DNA的快速少量抽提

　　（1）同本節　二.（三）.1.

　　（2）菌液移至5ml Eppendorf 管中，9000rpm,離心9min，去上清。

　　（3）加溶液Ⅰ100μl，溶液Ⅱ200μl，溶液Ⅲ150μl，混勻，冰浴10min。

　　（4）15000rpm離心15min。

　　（5）吸取上清，加入異丙醇1ml混勻，置室溫15～30min。

　　（6）15000rpm離心15min，棄上清，加入75%乙醇洗滌2次。

　　（7）離心棄上清，真空抽干，加入適量1×TE溶解DNA。

　　（8）取少量DNA電泳，觀察濃度。

　　2．轉化子DNA的小量酶切鑒定　　同質粒DNA的小量酶切鑒定，見本節　一（三）。

（五）重組子DNA的進一步鑒定

　　可用Southern印跡雜交法或斑點雜交法等進一步鑒定，詳見本節　四。

　　[附]電泳洗脫法回收酶切DNA片段

　　（1）用合適的酶切割DNA并電泳。

　　（2）于紫外燈下從凝膠上切下所要的DNA帶，裝入含1×TBE緩沖液的透析代內，用夾子封好袋口，并檢查有無漏孔。

　　（3）將透析袋（縱長）與兩極間的邊線垂直放于電泳槽內電泳，4～5V/cm電泳至DNA貼緊袋壁。

　　（4）取出透析袋，擠出凝膠塊，吸出袋內液體放入1.5ml的離心管內，10000rpm離心5min。

　　（5）吸出上清放入離心管內，加入等體積的飽和酚和等體積的氯仿，振蕩混勻，10000rpm離心5min，吸出上清放入新的離心管內。

　　（6）加入1/10體積的3mol/L AaAc,2倍體積預冷的無水乙醇，于-20℃放置4～5h。

　　（7）于4℃，10000rpm離心15min，棄上清。

　　（8）用75%的酒精洗滌2次，每次均于4℃，10000rpm離心5min，棄上清。

　　（9）真空抽干，并用適量1×TE溶解沉淀。如此即得所需DNA片段。