CDNA文庫篩選

CDNA 文庫篩選

（一）λ gt11 cDNA 文庫鋪平板

宿主細菌制備

1． 用一個 E.coli 宿主菌株單菌落分別接種 2 × 5ml LB 培養基（ Y1088 用于噬菌斑雜交， Y1090 用于免疫篩選），于 37 ℃振蕩培養過夜。

2． 將過夜培養物以 3000 × g 離心 5min 。

3． 分別用 2ml λ -dil （ 10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4 ; 高壓滅菌）重懸細胞沉淀。

4． 細胞懸液可用于 4 ℃貯存至一周。

預制噬菌體懸液鋪平板

以已知滴度（如，已知每 ml 噬菌體顆粒數）的 cDNA 文庫或其他噬菌體懸液開始，用λ－ dil 稀釋以達到所需每平板噬菌體數。每個 90mm 直徑平皿 5 × 103 個噬菌體 /100 μ l 開始篩選。

鋪平板

1． 將所需數量的 LB 平板置 42 ℃溫箱預熱。

2． LB 頂層瓊脂（每平板最少 2.5ml ）用微波爐熔化，然后置 49 ℃水浴中。

3． 為溫箱內的每一個平板準備一個 12ml 帶螺旋蓋試管，于室溫，放在合適的架子上。

4． 用移液器每管加 100 μ l λ－ dil 稀釋的宿主細胞懸液。

5． 每管加 100 μ l 稀釋的噬菌體懸液與細菌于漩渦器上簡短混合。

6． 含細菌和噬菌體（感染混合物）的試管于 37 ℃溫育 25min ，然后室溫放置。

7． 用一支消毒的 10ml 玻璃移液管在本生燈火焰上稍稍預熱，取 2.5ml 保存在 49 ℃的熔化頂層瓊脂加到一支含感染混合物的試管內。

8． 立即在手掌之間滾動混合管內混合物，然后均勻地倒入一個預熱的 LB 平板上。

9． 倒好的平板于室溫置水平面上直至頂層瓊脂凝固（至少 5min ）。

10． 重復步驟 7 至 9 ，直至所有的細菌和噬菌體混合物都鋪平板。

11． 平板置 42 ℃溫箱（對λ gt11 ）直至噬菌斑長出。

（二）雜交篩選―― cDNA 序列作為探針

1． 如上述將文庫鋪平板，噬菌斑雜交實驗用 E.coli 宿主菌株 Y1088 。

2． 噬菌斑于 42 ℃生長過夜。

3． 從溫箱取出平板，置 4 ℃冷卻至少 1h 。

4． 膜剝離：首先，用軟鉛筆在干的硝酸纖維素濾膜上給準備影印的平板編號。其次，從平板的中央開始向邊緣小心將濾膜鋪在菌臺上。當濾膜完全變濕后（顏色變灰），再等 30s 。同時，用針頭在平板上標出濾膜的 3 個不對稱位置。小心將濾膜從平板上剝離，接觸面向上放在一張干凈的 Whatman 3MM 濾紙上。在進行下一步驟之前，所有的平板重復步驟 4 。

5． 將濾膜接觸面向上漂浮在變性液（ 0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/L NaCl ）中 5min 。

6． 中和 5min 。

7． 用 2 × SSC 洗滌 5min 。

8． 將濾膜放在一張新的 Whatman 3MM 濾紙上，用鉛箔將濾膜和濾紙一起包住。

9． 在真空爐中 80 ℃烘烤 2h 。

10． 用 6 × SSC 預先短暫地濕潤濾膜，然后用預洗液（ 50 mmol/L Tris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1% SDS ）于 68 ℃預洗滌至少 1h 。用一個盤子放在水浴搖床上。

11． 將 25 張濾膜轉移到一個裝有 50ml 雜交液（ 5 × SSPE ； 1 × Denhardt’s 液； 100 μ g/ml cT-DNA ； 0.1 ％ SDS ）的貯存罐內（直徑至少 90mm ）， 68 ℃預雜交 2h 。

12． 對于每 ml 雜交液， 2 倍的 105 至 1 × 106 cpm 的雙鏈探針經沸水浴變性 10min 后，迅速放冰上冷卻。

13． 變性探針立即加到預雜交混合液中。

14． 在封口的貯存罐內于 68 ℃雜交過夜，不斷地晃動以防濾膜粘在一起。

15． 雜交結束后，濾膜用 2 × SSC ， 0.01 ％ SDS 于室溫洗滌 3 次約 1h 。

16． 將潮濕（防止干燥）的硝酸纖維素濾膜放在一張硬紙或 X 光片上，用放射性墨水在針頭標簽上作標記。

17． 濾膜用塑料包裝袋（如 Saran ）包住，然后加上增感屏在 X 光片上于－ 70 ℃曝光過夜。

（三）免疫篩選

制備 Sepharose 偶聯細菌裂解液

1． 各用一個 E.coli 溫度敏感溶源菌株（ BTA 282 （λ gt11amp3 ）或 BNN 97 ）單菌落接種于 2 × 7.5ml 培養基并于 32 ℃生長過夜。

2． 過夜培養物用 LB 培養基稀釋 100 倍，于 32 ℃生長至 OD600 值為 0.5 。

3． 于 45 ℃溫育 15min 誘導噬菌體表達。

4． 培養物于 39 ℃進一步培養約 2h 。

5． 測定噬菌體含量以便收集，氯仿測定操作步驟： 3 滴氯仿加到 1ml 培養物測試樣品中，混合物于 37 ℃溫育。另一份不加氯仿的培養物作為平行對照。溫育 5min 后，測試樣品與對照比較。如果添加氯仿的測試細胞懸液清澈透明，細菌完全被吸附，剛好開始裂解，此時已可收集培養物。

6． 于 4 ℃以 4000 × g 離心 10min 收獲細菌。

7． 從開始的兩份 7.5ml 培養物離心得到的細胞沉淀用冷的偶聯緩沖液重懸并再次離心。

8． 各用 5ml 冷的偶聯緩沖液重懸細胞沉淀。

9． 超聲波處理細胞懸液，直到粘度增加至不再釋放出核酸。

10． 將細菌裂解物偶聯到預先制備好的溴化氰活化 Sepharose 4B 于 4 ℃過夜。

11． 以 3000 × g 離心 5min 回收偶聯物。

12． 用偶聯緩沖液重懸沉淀并再次離心。

13． 為了飽和溴化氰活化 Sepharose 的未結合反應基團，沉淀物用冷（ 4 ℃）的飽和緩沖液重懸并在旋轉輪上于 4 ℃溫育 1h 。

14． 通過三次連續的洗滌除去未吸附蛋白質，開始用洗滌緩沖液（ pH4.0 ）；然后轉換至 pH8.0 ；最后一次洗滌 pH 為 4.0 ，在這個處理前后和每次洗滌之間，在 4 ℃， 2500 × g 離心 5min ，收集材料。

15． Sepharose 偶聯細菌裂解液可以 PBS 懸液（＋ 0.01 ％硫柳貢）于 4 ℃貯存幾個星期。

用于篩選的抗體預吸附

1． 濃度為 0.5 至 1 mg/ml 未稀釋的第一抗體和第二抗體（如過氧化物酶偶聯羊抗兔抗體， Calbiochem 公司）分別用 1.7 倍體積的 Sepharose 偶聯細菌裂解液混合，并在旋轉輪子上于 4 ℃溫育過夜。每次篩選循環約需要 300 μ l 已處理的第一抗體（最終工作稀釋度為 1 ： 100 ）和 15 μ l 已處理的第二抗體（最終工作稀釋度為 1 ： 2000 ）。

2． 懸液加到少量玻璃棉填充的加樣器吸頭內。未封閉抗體用冷凍封閉液（至少 5 倍于柱體積）洗脫。

3． 用冷的封閉液調節洗脫出的抗體濃度至原先濃度的 1/20 。加入硫柳汞（終濃度 0.01 ％）。

鋪平板

1． 如上所述鋪制平板，作如下修改：

a. 另外一支含 2.5ml 頂層瓊脂的 12ml 帶螺旋蓋試管置 49 ℃水浴中以鋪制誘導對照平板。

b. 在一份感染混合物中，用 100 μ l 噬菌體懸液含已知百分比的具有完整β - 半乳糖苷酶基因的野生型噬菌體作為誘導對照。

c. 在加相應感染混合物前，為鋪制誘導對照平板 20 μ l X-gal 立即加到 2.5ml 頂層瓊脂中。

2． 于 42 ℃溫育 3 ～ 4h （用 E.coli Y1090 ）直至噬菌斑可見。

3． 將平板移到層流櫥內，用 IPTG 浸泡過的硝酸纖維素濾膜覆蓋在上面以誘導噬菌體 lacZ 基因表達。對每個平皿，用軟鉛筆在干的硝酸纖維素濾膜上編號，然后在平皿內用 IPTG 溶液浸泡。排去平皿邊緣多余的液體，然后從平板的中央開始往邊緣小心地將濾膜放在長有細菌的平板上。濾膜總是用平頭鑷子操作。

4． 于 37 ℃溫箱倒置培養過夜。

5． 誘導對照平板上的某些噬菌斑過夜培養后，由于完整的β - 半乳糖苷酶表達將變成藍色，表明 IPTG 誘導成功。

6． 從平板上剝離濾膜前，應該用針頭在濾膜上標出 3 個不對稱位置。

7． 然后小心地從平板上剝離濾膜，接觸面向上放在 Whatman 3MM 濾紙上，直至所有的濾膜揭下。

免疫學染色

1． 為了洗去頂層瓊脂上的殘余物和細胞碎片，將硝酸纖維素濾膜一次最多 5 張轉移放在搖床上的盤子（ 10 × 10cm ）內，用 25ml TBS 室溫洗滌 10 min 2 次。

2． 然后濾膜用 25ml 封閉緩沖液（每張 90mm 直徑的濾膜至少 15ml ）于室溫溫育 30min ，以封閉濾膜上的非特異性結合位點。不斷晃動以防濾膜互相粘在一起。

3． 每張濾膜置佩特里平皿中，各用 3ml 含預吸附第一抗體的封閉緩沖液溫育。多克隆第一抗體的經典工作稀釋度為 1 ： 100 。抗體的這種工作稀釋度可以重復使用到 5 次并于 4 ℃保存。室溫下用第一抗體溫育至少 2h 。為了確保濾膜仍然完全浸泡在抗體溶液中，溫育過程中，將平皿放在搖動平臺上。

4． 室溫下用 25ml TBT 洗膜 3 次，每次 10min ，并不斷搖動以除去未結合第一抗體。

5． 本步驟操作同步驟 3 。 3ml 封閉緩沖液內預吸附第二抗體的工作稀釋度通常為 1 ： 2000 （如過氧化物酶偶聯羊抗兔抗體， Calbiochem 公司）。第二抗體工作溶液使用不得超過一次。第二次使用后，第二抗體工作溶液的吸附能力似乎耗盡，經常導致陽性信號的突然丟失。

6． 用 25ml TBS 于室溫下搖動洗膜 3 次，每次 10min 以除去未結合的第二抗體。

7． 在一個塑料盤內， 45ml 冷（ 4 ℃）的酶反應緩沖液與 5ml 冷（－ 20 ℃）的氯萘酚和 50 μ l H2 O2 混合。將濾膜一次最多 5 張放在顯影液內并緩慢攪動。幾分鐘內陽性噬菌斑顯示出紫紅色。

8． 如果用 Polaroid 攝影術（ 665 型膠卷，光圈 4.5 ，快門速度 1/15 ，橙色濾光片）記錄結果，將硝酸纖維素膜放在曝光箱內。

9． 為了有助于挑取陽性菌體斑，在拍照的透明膠片上用針頭做相應的標記。

噬菌斑純化

1． 用一支消毒的鈍頭巴斯德吸管刺入對應于陽性菌體斑位置的頂層瓊脂，通常很容易從平板上取下薄的環狀頂層瓊脂并用 0.5ml λ -dil 重懸于一支 Eppendorf 管內。

2． 挑取的噬菌斑所含的噬菌體顆粒通過劇烈的旋渦振蕩至少 1h ，從頂層瓊脂釋出，在再次鋪平板前，新制備的噬菌體懸液置室溫下至少 1h 。

3． 在 10 － 3 至 10 － 5 范圍內稀釋的噬菌體懸液重懸篩選陽性信號。

4． 重復步驟 1 至 3 ，直到從一個原始噬菌體感染在頂層瓊脂上挑取一個陽性噬菌斑為止。

噬菌體增殖

1． 為了獲取高滴度的均一噬菌體懸液，每個噬菌斑噬菌體懸液取 150 μ l 至 250 μ l ，加入 E.coli Y1088 鋪平板以便擴增。

2． 于 42 ℃過夜培養后，每噬菌體克隆的一個平板裂解物用 7ml λ -dil 覆蓋，于室溫持續搖動 5h 提取噬菌體顆粒。

3． 用一支消毒的 10ml 移液管吸取含噬菌體的上清液，小心避免細胞碎片。加入幾滴氯仿，上清液可作為噬菌體貯存液于 4 ℃無限期保存。

4． 每毫升懸液噬菌體原種滴度應在 109 ～ 1010 噬菌體顆粒范圍內。如果噬菌體原種未包含足夠的噬菌體，重復步驟 1 ～ 3 ，直至達到足夠的噬菌體滴度為止。

5． 必須通過對高度稀釋的噬菌體原種（最多幾百個噬菌體）再次鋪平板測試噬菌體原種的均一性，并用探針重新篩選。至少 99 ％的測試的噬菌體是陽性才能認定測試的噬菌體原種是“均一的”。

（四）噬菌體顆粒純化， DNA 分離和亞克隆

1． 準備 10 個 LB 平板，用 E.coli Y1088 鋪平板，每個平板至少 105 個噬菌體。 42 ℃溫育過夜。

2． 含噬菌體上清液按前述方法制備，從所有平板收集上清液（ 10 × 5ml ）。

3． 將收集的上清分成兩份 25ml 分裝于 40ml 聚丙烯離心管內。

4． 加入 25 μ l RNA 酶 A 和 DNA 酶 I 完全消化細菌核酸，于室溫放置 30min 。

5． 每管加入 1.46g NaCl 并使之完全溶解，室溫放置 1h 后，于 4 ℃以 10 000r/min 離心 10 min 除去細胞碎片。

6． 將上清轉入一干凈 40ml 聚丙烯離心管，加入 2.5g PEG ，于室溫持續攪拌 30min 使其完全溶解，置冰上過夜 PEG 促使噬菌體顆粒形成沉淀。

7． 于 4 ℃以 10 000r/min 離心 10min 回收沉淀的噬菌體顆粒。

8． 棄上清液，小心用軟紙擦拭離心管內壁。

9． 將來源于同一噬菌體克隆的兩份沉淀物用 4ml SM 重懸并收集。用 5ml 移液管上下抽吸使乳狀沉淀物混勻。

10． 加 4ml 氯仿，旋渦振蕩 30 秒，去除 PEG ；于 4 ℃以 1 600 × g 離心 15min 。

11． 將水相（頂層）轉移至一干凈的 12ml 聚丙烯管內，用 SM 精確地調節體積至 4ml 。棄去膠狀的有機相和中間相。

12． 在一支 14ml polyallomer 超離心管（ Kontron 公司）內，氯化銫分級梯度的制備從底層至頂層： 3ml 氯化銫密度為ρ＝ 1.7 ； 1.5ml （ρ＝ 1.5 ）； 1.5ml （ρ＝ 1.45 ）。

13． 每 4ml SM 噬菌體懸液溶解 2g 固體氯化銫。

14． 將噬菌體懸液置氯化銫分級梯度上，在 Backman SW40 轉頭或相當的轉頭上以 30 000r/min 于 4 ℃離心 2h 。

15． 小心從轉頭內取出離心管，放在強光下。此時噬菌體顆粒清晰可見呈乳狀條帶位于 1.5 和 1.45 密度區的中間相。用 18G 針頭從離心管旁側刺入，以收集噬菌體顆粒。約 1.5ml 體積。

16． 用 SM 將收集的樣品體積升至 6ml ，加入固體氯化銫（通常約 3g ）直到溶液的折射率精確為 1.380 。樣品體積進一步用氯化銫溶液（ 0.75g/ml ）擴至終體積為 9.5ml 。

17． 噬菌體顆粒通過持續密度滴度再次離心。

18． 如步驟 15 收集噬菌體顆粒，用于以標準步驟抽提 DNA 。