DNA的克隆

DNA的克隆是指在體外將含有目的基因或其它有意義的DNA片段同能夠自我復制的載體DNA連接，然后將其轉入宿主細胞或受體生物進行表達或進一步研究的分子操作的過程，因此DNA克隆又稱分子克隆，基因操作或重組DNA技術。

DNA克隆涉及一系列的分子生物學技術，如目的DNA片段的獲得、載體的選擇、各種工具酶的選用、體外重組、導入宿主細胞技術和重組子篩選技術等等。

一 目的DNA片段的獲得

DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群DNA分子，這些DNA分子或來自于目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉錄合成的雙鏈cDNA分子。由于基因組DNA較大，不利于克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。

若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組DNA 或cDNA中通過PCR技術可以獲得目的基因。

二 載體的選擇

基因工程的載體應具有一些基本的性質：

1）在宿主細胞中有獨立的復制和表達的能力，這樣才能使外源重組的DNA片段得以擴增。

2）分子量盡可能小，以利于在宿主細胞中有較多的拷貝，便于結合更大的外源DNA片段。同時在實驗操作中也不易被機械剪切而破壞。

3）載體分子中最好具有兩個以上的容易檢測的遺傳標記（如抗藥性標記基因），以賦予宿主細胞的不同表型特征（如對抗生素的抗性）。

4）載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點，為避開外源DNA片段中限制酶位點的干擾提供更大的選擇范圍。若載體上的單一酶切位點是位于檢測表型的標記基因之內可造成插入失活效應，則更有利于重組子的篩選。

DNA克隆常用的載體有：質粒載體（plasmid），噬菌體載體（phage），柯斯質粒載體（cosimid），單鏈DNA噬菌體載體（ssDNA phage ），噬粒載體（phagemid）及酵母人工染色體（YAC）等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體，表達載體，測序載體，穿梭載體等。

三 體外重組

體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割DNA分子形成有粘性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為粘末端連接。

當目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比粘端相連差些。

有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有粘末端的表達載體實現表達時，則要將平端DNA分子通過一些修飾，如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點等，可以獲得相應的粘末端，然后進行連接，此為修飾粘末端連接。各種連接策略間的關系總結如下：

四 導入受體細胞

載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的復制起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中復制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。

將外源重組DNA分子導入原核宿主細胞的方法有轉化（transformation），轉染（transfection），轉導（transduction）。重組質粒通過轉化技術可以導入到宿主細胞中，同樣重組噬菌體DNA可以通過轉染技術導入。

轉染效率不高，因此將重組噬菌體DNA或柯斯質粒體外包裝成有浸染性的噬菌體顆粒，借助這些噬菌體顆粒將重組DNA分子導入到宿主細胞轉導技術，這種轉導技術的導入效率要比轉染的導入效率高。

五 重組子的篩選

從不同的重組DNA分子獲得的轉化子中鑒定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。目前發展起來的成熟篩選方法如下：

（一）插入失活法

外源DNA片段插入到位于篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點后，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉化子是重組子或非重組子。目前常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法。

（二）PCR篩選和限制酶酶切法

提取轉化子中的重組DNA分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過PCR技術篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。

（三）核酸分子雜交法

制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。

（四）免疫學篩選法

獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以采用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。

上述方法獲得的陽性克隆最后要進行測序分析，以最終確認目的基因。