【實驗目的】

1．掌握DNA重組技術的基本原理和基本方法

2．熟悉質粒DNA的小量制備及酶切鑒定方法

【實驗原理】

1．DNA重組技術 重組DNA(Recombinant DNA)技術是遺傳工程的核心技術，也是人類在基因和DNA分子水平進行操作的技術。它包括以下幾個步驟： 1）重組DNA分子的構建：即將目的基因（DNA或cDNA片段）與載體DNA重組，應用TA克隆方法,將PCR擴增產物快速克隆至質粒載體中。

該方法利用了PCR過程中使用的熱穩定聚合酶(Taq酶)在所復制的雙鏈分子末端加上單一脫氧腺苷酸(A),從而產生一A-粘性末端的性質,設計一種線性載體,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR產物,在DNA連接酶作用下，目的DNA和載體DNA連接形成重組DNA分子。 2）將重組DNA分子轉化宿主細胞。 3）克隆選擇增殖：將轉化后的液體涂布于瓊脂培養基表面，培養基中含有宿主菌敏感的抗生素，重組DNA（TA克隆載體分子）含有相應抗生素的抗性基因，轉化的細菌能在培養基上生長形成集落。挑取菌落，置液體培養基中培養，得到大量含重組DNA的細菌。 4）收獲擴增后的培養細胞，提取重組DNA分子（質粒），并純化，獲得某一基因或DNA片段的大量拷貝。

2．質粒DNA的小量制備

常見的質粒DNA提取方法有簡易一步提取法、堿裂解法和煮沸法。本實驗采用的是堿裂解法，堿裂解法的原理：在PH 12.0~12.6堿性環境中，線性的大分子量細菌染色體DNA變性，而共價閉環質粒（CC）DNA仍為自然狀態。

將pH調至中性并有高鹽濃度存在的條件下，染色體DNA之間交聯形成不溶性網狀結構。大部分染色體DNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍為可溶狀態。通過離心，將可去除大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收質粒DNA。

3．質粒DNA的限制性內切核酸酶（限制酶）切分析

限制酶存在于原核生物體內，根據其結構和功能特性分為：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。Ⅰ型切點不固定，Ⅲ型其切割位點在識別位點之外，只有Ⅱ型其特異性切點位置可以控制和預測，可以產生固定的DNA片段，基因工程中所用的限制酶均為Ⅱ型限制酶。

這類酶的特點是具有能夠識別雙鏈DNA分子上的特異性核苷酸序列的能力，能在這個特異性核苷酸序列內切斷DNA雙鏈，形成一定長度和順序的DNA片段。

選擇合適的限制酶對重組的環狀質粒進行酶切，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，用已知相對分子量的線狀DNA（DNA分子量標志）及未經酶切的重組環狀質粒為對照，可以對重組環狀質粒中的目的DNA分子進行初步鑒定。

【實驗用品】

1．PCR擴增儀；恒溫振蕩培養箱；超凈工作臺；細菌恒溫培養箱；臺式高速離心機；電熱恒溫水浴箱；冰箱；電泳儀； 電泳槽，樣品槽模板（梳子）；紫外燈；保鮮膜；一次性塑料手套；凝膠自動成像儀。

2．三角燒瓶（500ml, 250ml,100ml）,培養皿，玻璃試管，試管塞，玻璃棒，酒精燈，鑷子，脫脂棉，紗布，乙醇，容器盒。

3．微量加樣器（1000μl,200μl，20μl）；Tip頭（1000μl,200μl，20μl）。Tip頭盒（1000μl,200μl，20μl）；Eppendorff管（2ml,1.5ml,0.5ml），Eppendorff管架。Parafilm，透明膠帶。

4．DNA重組相關試劑：

1）Taq DNA聚合酶，緩沖液，dNTP，特異性引物，靶DNA；凝膠回收試劑盒；TA克隆載體：pMD18-T；感受態細菌；氨芐青霉素（100mg/ml）。

2） LB培養基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，10N NaOH調pH至7.0定容至1L。15磅高壓消毒，4℃保存。

3）LB瓊脂培養基：15g瓊脂粉溶于1000ml LB培養基，15磅高壓消毒備用。

5．質粒提取試劑：

溶液Ⅰ(10×)：0.5M葡萄糖；0.25M Tris-Cl (pH8.0)；0.1M EDTA，10磅高壓消毒，4℃保存備用.

溶液Ⅱ:0.2N NaOH;1%SDS 室溫貯存，即用即配。

溶液Ⅲ:3M NaOAc(pH4.8) 10磅高壓消毒,室溫貯存。

RNA酶 A: 10mg/ml

TE緩沖液：10mM Tris-Cl (pH7.6)，1mM EDTA(pH8.0)

6．質粒DNA的限制性內切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳相關試劑：

限制性內切酶Hind Ⅲ、XbalⅠ及酶反應所需緩沖液；瓊脂糖；溴化乙啶貯存液（10mg/ml）；6×載樣緩沖液。

Tris-乙酸(TAE)貯存液：

50×：242克Tris堿，57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加水至1L

【實驗步驟】

1．PCR產物純化PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段。

2．目的DNA片段連接至T/A克隆載體 即重組DNA分子的構建

3．轉化

3.1 將感受態細胞置冰中融解。

3.2 將60μl感受態細胞移至無菌試管內。

3.3 加入用于轉化的DNA 10μl（＜10ng），輕彈管底混勻。

3.4 冰中放置30分鐘。

3.5 42℃放置45~60秒，不要振蕩。

3.6 冰中放置2~3分鐘。

3.7 加入37℃ 預溫好的LB培養基940μl（無抗生素）。

3.8 37℃振蕩培養1小時（160~225 rpm）。

4．篩選及增菌

4.1 取適量涂布瓊脂平板。

4.2 37℃培養過夜。

4.3 挑取菌落，放在2~5ml LB液體培養基中（含50μg/ml Amp）過夜培養（240 rpm）。

4.4 收集細菌，提取質粒。

5．質粒DNA提取

5.1 2ml 菌液以12000rpm離心1分鐘。

5.2 棄上清，沉淀物溶于100μl溶液Ⅰ（1×）中，劇烈振蕩，室溫5分鐘。

5.3 加新配制的溶液Ⅱ200μl，充分混合后冰浴5分鐘。

5.4 加溶液Ⅲ 150μl，混勻冰浴5分鐘。

5.5 12000rpm離心10分鐘,將上清轉移到另一離心管中。

5.6 加900μl（2倍體積）的乙醇，震蕩混合,室溫放置2分鐘，沉淀雙鏈DNA。

5.7 12000rpm離心5分鐘。

5.8 小心吸去上清液,將離心管倒置于一張紙巾上,以使所有液體流出.再將附于管壁的液滴除盡。

5.9 用1ml 70%乙醇洗滌沉淀的雙鏈DNA,按“步驟5.8”所述方法去掉上清,在空氣中使沉淀的DNA干燥10分鐘。

5.10 用50μl含胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解核酸,振蕩,貯存于-20℃。

6．質粒DNA的限制性內切酶酶切及瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定

6.1 質粒DNA的限制性內切酶酶切

將清潔、干燥、滅菌的Eppendorff管（0.5ml）編號，用微量加樣器按表1所示將各種試劑分別加入每個管內，加樣后，小心混勻，置于37℃水浴消化過夜，然后65℃ 20分鐘終止酶解反應。各酶切樣品于-20℃貯存備用。

6.2 瓊脂糖凝膠電泳分離、鑒定質粒DNA酶切片段

6.2.1膠板的準備

取有機玻璃內槽，洗凈晾干。取透明膠帶將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好（注意，將透明膠帶緊貼于有機玻璃內槽的兩端邊上，不要留空隙）。將有機玻璃內槽置于一水平位置，在距離底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。

6.2.2瓊脂糖凝膠的制備

稱取0.6克瓊脂糖，置于錐形瓶內，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鮮膜封蓋，在微波爐中加熱直至瓊脂糖全部溶解，得到1.2 %瓊脂糖凝膠液，待其冷卻至65℃左右，加入2.5μl溴化乙啶貯存液（10mg/ml），使溴化乙啶終濃度為0.5μg/ml。

小心混勻并倒在有機玻璃內槽中，控制灌膠速度，使膠液緩慢展開，避免產生氣泡，直到在整個有機玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置1小時左右，待膠凝固完全后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。將凝膠放入電泳槽中，加入恰好沒過膠面1mm深的足夠電泳緩沖液，預電泳10分鐘。

6.2.3加樣

取適量的酶切樣品，加入6×載樣緩沖液適量（終濃度為1×），用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內。

6.2.4電泳

加完樣品后的凝膠板立即通電進行電泳，DNA帶負電荷，由負極向正極移動。電場強度不高于5V/cm。當溴酚藍染料移動到距離膠板下沿1~2cm處，停止電泳。

6.2.5觀察和拍照

取出凝膠，在波長為254 nm的紫外燈下觀察凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。在紫外燈下觀察時，應戴上防護眼鏡或采用有機玻璃防護罩，避免眼睛遭受強紫外光損傷。

以上步驟也可以用凝膠自動成像儀處理。

【實驗結果分析】

1．記錄DNA重組的方法。

2．觀察分析經酶切質粒DNA（實驗組）和未經酶切質粒DNA（對照組）瓊脂糖凝膠電泳結果。