BAC提取前準備（前兩天 ）

配制含25 mg/l Kan的LB培養基選擇平板，在超凈工作臺上用接種環從購買的BAC劃線接種至選擇平板，于37℃培養箱培養過夜，供選擇單。

BAC提取前準備（前一天）

1、在超凈工作臺上，用50 μg/ml Kan和液體LB培養基配制成25 mg/l Kan培養基，每個Falcon試管分裝10 ml。也可先分裝10 ml無抗生素的液體LB培養基后，然后每管中加5 μl濃度為50 μg/ml Kan溶液。

2、在培養皿中標出三個單克隆 （不要太大，不要太小），用牙簽挑取第1個單克隆 一半，在的的小培養皿固體LB培養基（分裝10 ml，含25 mg/l Kan）上劃一橫線，標上序號；接著用同一根牙簽挑取第1個單克隆 的另一半接種到剛配制好的液體培養基中。

第2、3個單分別用牙簽挑取在同一個小培養皿固體LB培養基上劃一橫線，分別標上序號。

3、接種的固體培養基置于37℃培養箱過夜。接種到Falcon試管中的E.coli 進行液體振蕩培養（37℃，240 rpm）20小時。

BAC提取（第二天）

將緩沖液P1按要求加入RNase A，置于冰上。緩沖液P3也置于冰上。取出適量緩沖液QF在65℃條件下預熱。其他緩沖液在常溫下保存。

1、接種的固體培養基從37℃培養箱中取出，用包裝膜封好后置于4℃條件下貯存。取液體振蕩培養的Falcon試管到超凈工作臺中，在微量離心管中分裝300 μl的E.coli 和300 μl 30%glycerol的LB培養基，用移液器上下吹吸混勻，置于-80℃貯存。

2、將Falcon試管在室溫條件下2700 rpm離心20 min。丟棄上清，將沉淀置于冰上。

3、在0.6 ml緩沖液P1中重懸細菌沉沉小球。邊吹吸邊攪動，混勻而不要出塊菌塊，然后全部轉移到2 ml 微量離心管中。

4、加入0.6 ml緩沖液P2，上下倒置數次，輕輕混和，在室溫下培養5 min。

5、加入0.6ml冰冷的緩沖液P3，立即上下倒置數次，輕輕混和，在冰上培養5 min。

6、用微量離心器在最大速度下（13000 rpm）離心10 min。此時可支起過濾架，標好QIAGEN-tip 20尖管。

7、利用1 ml緩沖液QBT對QIAGEN-tip 20尖管進行平衡處理，讓其在重力作用下從柱中流出。

8、將離心后的上清倒入QIAGEN-tip 20尖管，讓其在重力作用下進入樹脂。

9、用4 ml緩沖液QC對QIAGEN-tip 20尖管進行清洗2次，每次用2 ml。

10、清洗后將1.5 ml或2 ml微量離心管置于QIAGEN-tip 20尖管頭下，用0.8 ml預熱的緩沖液QF分兩次稀釋DNA 。每次0.4 ml。

11、用0.7體積（每0.8 ml稀釋體積用0.56 ml）的isopeopanol在室溫下沉淀DNA 。立即用微量離心機中在13000 rpm 轉速下離心30 min。

此步以后在離心機上操作要注意離心管的放置方向，保持沉淀方向一致或作好標記。以利于用移液管移吸上清，不會攪動沉淀。另外，抽吸剩下少量（約50 ml）溶液可再離心一次，之后全部吸出上清。

12、用1 ml 70%酒精加入微量離心管中（洗滌DNA ），在13000 rpm 轉速下離心5 min。先用移液器從沉淀小球對面移去大部分酒精，抽吸剩下少量（約50 ml）溶液再置于13000 rpm 轉速下離心5 min。然后移出酒精，在通風處或超凈工作臺送風條件下風干，但不宜過干，過干很很難溶解。

13、用20 μl TE緩沖液（pH 8）溶解DNA ，置于冰上，每10 min 彈擊微量離心管，以促進DNA 溶解。之于置于4℃條件下過夜。

14、第三天可將DNA 取出，在60℃條件下預熱一小時，每10 min 彈擊微量離心管，以促進DNA 溶解。之后在1%的瓊脂糖膠上鑒定。