腺病毒RNAi干擾
(1)原理 腺病毒(adenovirus,AV)是一種沒有包膜的線狀雙鏈DNA,它能感染分裂細胞和非分裂細胞,在核內以神經元細胞的形式復制,存在多種AV血清型。到目前為止,構建的絕大多數載體都是基于血清型2和5,通過轉基因的方法取代E1或E3基因,降低病毒的復制能力。這些重組病毒僅在表達高水平E1和E3基因的細胞中復制,因此適合應用于治療的高效控制系統。腺病毒載體能夠高效傳遞和表達基因的能力(尤其是在體外),由于具有宿主范圍廣,對人致病性低;在增殖和非增殖細胞中感染和表達基因;能有效進行增殖,滴度高;與人類基因同源;不整合到染色體中,無插入致突變性。對于難轉染的細胞,如原代或非分裂細胞,采用病毒遞送miRNA/shRNA的方式是非常有效的選擇。 (2)服務流程 1)構建表達miRNA/shRNA的腺病毒載體,采用PacI消化純化質粒使ITRs裸露出來。 2)將腺病毒表達克隆轉染293A細胞。收獲細胞以制備病毒粗提液。 3)將病毒粗提液感染293A細胞以擴增病毒。確定病毒滴度。 4)將病毒上清加入靶細胞中 5)分析miRNA/shRNA的表達和相應的Knockdonw結果 (3)您需要提供 1)表達miRNA/shRNA的質粒(提供測序圖譜)或所要Knockdown的靶基因的名稱、序列; 2)所需要的病毒滴度及總量,病毒是否需要純化 3)若需要檢測靶基因的表達變化,如需要請提供相應的抗體 (4)我們提供 1)提供重組后的腺病毒載體質粒,并附上PCR鑒定結果 2)提供已測定好滴度、可以直接進行后續分析的腺病毒儲存液