為最大程度的保證實驗結果，我們推薦客戶嚴格遵循 CST 的實驗操作方法，這些實驗方法經過 CST 科學家的反復驗證，能夠保證實驗結果的精確性和可重復性。

流式細胞術方案

A. 所需溶液和試劑

1. 1X 磷酸鹽緩沖液（PBS）：將 8 g 氯化鈉（NaCl），0.2 g 氯化鉀（KCl），1.44 g 磷酸氫二鈉（Na2 HPO4），0.24 g 磷酸二氫鉀（KH2PO4）溶解在 800 ml 蒸餾水（dH2O）中。用鹽酸調節 pH 到 7.4，定容至 1 升。室溫保存。

2. 甲醛溶液（無甲醇的）。

3. 孵育緩沖液：將 0.5 g 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶解在 100 ml 的 1 X PBS 中。保存在 4°C。

B. 固定

1. 離心收集細胞，棄上清。

2. 將細胞重懸在 0.5-1 ml PBS 中。加入甲醛溶液至終濃度為 2-4%。

3. 37°C 固定 10 分鐘。

4. 放在冰上降溫 1 分鐘。

5. 做細胞外染色不需要細胞膜打孔時，繼續 D1 步或將細胞保存在 4°C 含有 0.1% 疊氮鈉的 PBS 中；做細胞內染色時，繼續 C1 步給細胞膜打孔。

C. 細胞膜打孔

1. 邊輕輕震蕩邊將冰冷的 100% 甲醇緩慢加入到預冷的細胞中，至終濃度為 90%。或者也可以在細胞膜打孔前離心去除固定劑，然后將細胞沉淀重懸在 90% 甲醇 PBS 溶液中。

2. 在冰上放置 30 分鐘。

3. 進入染色步驟或是將細胞在 90% 甲醇 PBS 溶液中，-20°C 保存。

D. 免疫染色

注意：單克隆抗體設立相應亞型的對照，而多克隆抗體需要對應種屬的 IgG 作為對照。用血球計數法或是其他方法對細胞計數。

1. 將 0.5-1 x 106 個細胞分到各檢測管中（依照體積）。

2. 各管加入 2-3 ml 孵育緩沖液漂洗，離心回收細胞。重復一次。

3. 將每個管中的細胞重懸在 100 μl 孵育緩沖液中。

4. 室溫，孵育緩沖液封閉 10 分鐘。

5. 按合適的稀釋比例在檢測管中加入未標記，生物素標記或是熒光素標記的一抗。具體的用量參考抗體各自的說明書。

6. 室溫孵育 1 小時。

7. 同第二步，用孵育緩沖液清洗，離心回收細胞。

8. 如果是熒光素標記的一抗，則將細胞重懸在 0.5 ml PBS 中然后用流式細胞儀檢測。如果是未標記或者生物素標記的一抗，則繼續 D9 步。

9. 用孵育緩沖液按推薦比例稀釋熒光素標記的二抗或抗生物素蛋白 avidin，將細胞重懸在該稀釋液中。

10. 室溫孵育 30 分鐘。離心去除稀釋液。

11. 同第二步，用孵育緩沖液清洗，離心回收細胞。

12. 將細胞重懸在 0.5 ml PBS 中然后用流式細胞儀檢測。或者繼續 E1 步 DNA 染色。

E. DNA 染色（可選）

1. 將細胞重懸在 0.5 ml DNA 染色液中（例如 DRAQ5? #4084）。

2. 室溫至少孵育 5 分鐘。

3. 流式細胞儀進行分析。

? 推薦的二抗：

抗兔：

? Anti-Rabbit IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor? 488 Conjugate）#4412

? Anti-Rabbit IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor? 555 Conjugate）#4413

? Anti-Rabbit IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor? 647 Conjugate）#4414

抗小鼠：

? Anti-Mouse IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor? 488 Conjugate）#4408

? Anti-Mouse IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor? 555 Conjugate）#4409

? Anti-Mouse IgG（H+L）， F（ab'）2 Fragment（Alexa Fluor? 647 Conjugate）#4410

抗大鼠：

? Anti-Rat IgG（H+L），（Alexa Fluor? 488 Conjugate）#4416

? Anti-Rat IgG（H+L），（Alexa Fluor? 555 Conjugate）#4417

? Anti-Rat IgG（H+L），（Alexa Fluor? 647 Conjugate）#4418