ChIP（染色質免疫共沉淀，Chromatin Immunoprecipitation）技術是現代分子生物學研究，特別是表觀遺傳學的機制研究中一種非常重要的研究手段。ChIP 技術的主要目的是研究目的蛋白（包括： 修飾組蛋白， 轉錄因子， 輔因子及其他染色質蛋白）在染色質上的定位及豐度分析。

ChIP 技術可以幫我們解答特異性修飾組蛋白或轉錄因子在染色質上是如何分布的，通過分析它們的染色質定位可以為解碼目的蛋白的功能提供幫助。以組蛋白修飾為例，組蛋白 H3 的第四位賴氨酸三甲基化（H3K4me3）主要定位在轉錄活躍基因的啟動子 CpG 島上，這提示我們 H3K4me3 跟轉錄激活相關[1,2]；而組蛋白 H3K27me3 主要分布在轉錄抑制的基因上，這提示我們 H3K27me3 跟轉錄抑制相關[3,4]。再以轉錄因子為例，如果我們知道某種轉錄因子定位在哪些基因的啟動子上，我們就可以知道，這個轉錄因子調控哪些基因表達。而豐度的多少可以提示這種轉錄因子對不同基因的調控強度。

ChIP 技術與蛋白復合物鑒定，體外酶活實驗，基因敲低/敲除等實驗相結合可以有效的幫我們解決很多表觀遺傳學的機制問題。

ChIP 實驗原理

ChIP 技術的原理：1）通過甲醛將染色質上的 DNA 和目的蛋白交聯，2）通過超聲或酶解的方法將染色質片段化，3）包含有目的蛋白的染色質片段通過抗體富集純化，4）通過加熱解除 DNA 和目的蛋白的交聯，5）通過蛋白酶和 RNA 酶消化去除目的染色質的蛋白和 RNA 之后，將目的 DNA 純化出來。6）得到的 DNA 可以通過 PCR 檢測目標區域的 DNA 是否被目的蛋白富集，或者通過 DNA 測序的方式檢測目的蛋白在全基因組上的分布[5]。

ChIP 原理看似簡單，但要想得到高質量的 ChIP 數據卻非常具有挑戰性。在每個關鍵步驟都有很多需要注意的細節。

下面是 Active Motif ChIP 實驗專家根據多年經驗總結的每個步驟中的原理及一些需要注意的細節。

第一步 染色質交聯

為什么要用甲醛交聯？

ChIP 技術主要是一種解碼信息（目的蛋白在染色質上的分布）的方法。對于解碼信息，首先就需要確保信息保存下來而不失真，ChIP 技術用到的最主要的信息保存方式是甲醛交聯。甲醛交聯也是 ChIP 實驗非常關鍵的一個步驟。最早的 ChIP 技術是不用甲醛交聯的[6]，只是后來發現甲醛交聯能更好的保存蛋白與 DNA 的相互作用[7]，所以后來除了用于檢測組蛋白修飾分布的 Native ChIP 以外[8]，其他的 ChIP 基本上都需要用甲醛交聯。

甲醛作為交聯劑有幾個好處：

1）甲醛是一種非常活躍的小分子，它本身可以非常容易的穿過細胞膜及核膜進入細胞核，并通過醛基將 DNA 堿基上的氨基/亞氨基與蛋白的堿性氨基酸上的氨基/亞氨基交聯[5]。2）甲醛的交聯是可逆反應，可以通過加熱的方式解除交聯，從而方便后續的 DNA 分析[7]。

但是甲醛交聯本身也有缺點：第一，甲醛交聯本身需要一定的反應時間，對于小于 5s 的 DNA 與蛋白之間的動態相互作用是無法用甲醛交聯捕獲到的[9,10]；第二，甲醛本身的分子量很小，它的作用距離是 2 埃，所以如果蛋白和 DNA，或蛋白和蛋白之間的相互作用距離大于 2 埃，甲醛不能起作用[11,12]。第三，因為甲醛交聯需要作用于氨基或亞氨基，如果目的蛋白與 DNA 作用區域沒有堿性氨基酸，兩者也不能被甲醛所交聯[7]。另外，甲醛交聯以后對蛋白本身的表位會有一定的影響，所以 ChIP 實驗用到的抗體跟普通做 IP 的抗體也是有所不同的。這就需要 ChIP 實驗使用 ChIP 級的抗體。抗體的問題將在后續做更詳細的介紹。

甲醛交聯有兩點需要注意：

第一，甲醛交聯用到的甲醛濃度和交聯時間都是有嚴格要求的。根據多年來大家的摸索，一般的甲醛交聯都選用 1% 的甲醛濃度，室溫固定 10～15 分鐘。時間太短的話，交聯反應進行的不徹底，很多蛋白與 DNA 的結合不是很牢固，交聯時間太長的話，會導致后續超聲非常困難，而增加超聲時間或功率會破壞目的蛋白本身的結構，進而導致 ChIP 結果不理想。

第二，為了盡可能保存細胞原始狀態下的目的蛋白在染色質上的定位，所以在甲醛交聯之前，細胞需要盡可能少被人為處理。如果條件允許的話，直接將甲醛加入培養基或將細胞培養基吸棄并換成含有 1% 甲醛的 PBS 交聯會比胰酶消化細胞以后再交聯更好一些。甲醛交聯反應結束之后，需要馬上加入相對甲醛過量的甘氨酸（一般甘氨酸終濃度為 125 mM）與甲醛反應，終止交聯反應。終止交聯之后，樣本需要經過 PBS 清洗（如果細胞數量比較少的話，可以在 PBS 里加入 0.1%～0.5% NP-40，這樣細胞在轉移時不會粘在管壁或培養皿上），細胞沉淀可以直接用液氮速凍，然后置于 -80 攝氏度長期保存。

組織的交聯相比細胞交聯要復雜一些。雖然甲醛可以很容易的透過細胞，但是大的組織塊還是不太容易交聯的很均一，所以大的組織塊交聯之前需要切成小塊。但也并不是說組織塊切的越小越好，組織塊切的越小，細胞破壞的越嚴重。所以一般建議用兩個刀片將組織塊切成 1～3 mm3 大小。組織的交聯時間一般可以延長到 15 min，這樣能保證組織的充分交聯。

另外，考慮到甲醛并不能很好的交聯距離大于 2 埃的 DNA 和蛋白，還有一些文獻報道用分子長度更長的交聯劑（一般是雙官能團的亞氨酸酯類）配合甲醛對蛋白和 DNA 進行交聯。比如，DTBP，DMA，DSG，DSP，EGS[11-13]。

第二步 染色質片段化

染色質交聯之后，需要通過超聲或酶切的辦法將染色質片段化。大部分實驗室偏好于用前者，而很多做 ChIP 試劑盒的公司根據客戶的需求（有些沒有超聲儀，有些把握不好超聲條件），也大都推出了用廣譜的核酸內切酶 MNase（Micrococcal Nuclease）酶切將染色質片段化的試劑盒。不管是用超聲還是酶切，染色質片段化大小是 ChIP 實驗的一個關鍵點。

以超聲為例，打斷后的 DNA 片段大小以 200～1 000 bp 為宜。DNA 片段太大，一方面影響 IP 效率，更重要的是會影響 ChIP 的分辨率。DNA 片段太小雖然理論上能得到更高的分辨率，但也會影響后續的 qPCR 和建庫。另外，需要注意的是，超聲是通過物理的作用力將 DNA 的共價鍵打斷，從而實現染色質片段化。其在破碎 DNA 的同時，也會在一定程度上破壞目的蛋白以及目的蛋白和 DNA 之間的相互作用。所以，超聲摸索應遵循適可而止的原則。

除超聲儀外，樣品制備本身有三個因素會對超聲效果產生影響：1，超聲用的 buffer。這其中尤其以 SDS 的影響最大，SDS 濃度越高，DNA 越容易被打斷。同時鹽離子和其他去垢劑濃度都會對超聲產生一定影響，一般認為鹽離子或去垢劑濃度越高，DNA 越容易被打斷。2，細胞密度。超聲時的細胞密度越高，DNA 越不容易被打斷。所以建議細胞密度應小于 107/ml 裂解液。3，細胞類型。不同細胞類型間，超聲效果差異也很大。相對于常用的腫瘤細胞系，很多原代培養的細胞以及組織細胞的染色質超聲破碎會更困難些。

超聲之后，一般需要先檢測超聲效果，確定 DNA 片段大小合適以后再做后續的 IP 實驗。超聲后的樣品高速離心后，取部分上清，進行解交聯。解交聯是一個溫度介導的共價鍵打開的化學反應[7]，溫度越高解交聯越快。通常的解交聯條件是 65 ℃ 孵育 4 h- 過夜。有些實驗室為了減少實驗時間也會選擇 95 ℃ 孵育 15 min。但是 95 ℃ 處理需要注意后續的緩慢退火過程，如果退火過快，DNA 就可能非正確復性，導致觀察到的 DNA 大小產生偏差。解交聯過程中可以加入適量的 NaCl，對 DNA 起到保護作用（據說是起保護作用，小編當年做 ChIP 時試過不加 NaCl 好像也沒有太大影響）。解交聯之后的染色質，加入適量的 RNase A，37 ℃ 處理 1 h 后，再加入適量的 Protease K 處理 1 h。消化處理之后的 DNA 可以經過抽提或 DNA 純化柱回收。

第三步 IP 反應

超聲之后的 IP 過程是 ChIP 成功與否的關鍵。這其中有兩個因素是比較重要的：首先是抗體。ChIP 實驗首先需要選用 ChIP 級的抗體。這個抗體需要滿足幾點要求：

識別目的蛋白的立體表位。這跟做 Western Blot 的抗體是有區別的，因為 WB 的抗體識別的是蛋白的變性表位。

識別甲醛交聯后的立體表位。這跟做 IP 的抗體是有區別的。因為 ChIP 相對于 IP 需要甲醛交聯的過程，甲醛會在 DNA 和蛋白質，以及蛋白和蛋白的氨基/亞氨基之間形成共價鍵，所以 ChIP 級的抗體還要識別甲醛交聯后的目的蛋白。這跟免疫熒光的抗體有點類似。

ChIP 級的抗體跟目的蛋白有足夠強的相互作用，能夠耐受高鹽，低鹽及多種去垢劑（比如 0.1% SDS，1% Triton X-100 或 NP-40）的清洗。所以選擇抗體時，最好選擇文獻報道可以用于 ChIP 實驗的抗體，或抗體公司提供 ChIP-qPCR 或 ChIP-seq 數據的抗體。

IP 的另外一個關鍵因素是 buffer，這包括 binding buffer（超聲用 buffer）和 wash buffer。因為組蛋白與 DNA 的結合比較牢固，所以相對來說組蛋白修飾的 ChIP 更容易做，對 buffer 的要求也不是太嚴格。但是對于很多轉錄因子來說，因為本身跟 DNA 不是特別緊密（很多都是動態結合），在同一染色質區域，只有很少部分細胞可以捕獲到目的蛋白和 DNA 的結合，所以通過合適的 buffer 將目的蛋白結合的 DNA 與背景 DNA 區分并分離出來就顯得很關鍵了。一般來說，選用的 Buffer 越劇烈，背景 DNA 去除的就會越干凈，但同樣的，目的 DNA 也會被更多的清洗掉。反之，選用的 buffer 越溫和，目的 DNA 得到的就會越多，但同樣的，背景 DNA 也就殘留的越多。對于去垢劑來說，離子型去垢劑（如 SDS，SDC）比非離子型去垢劑劇烈得多。對于鹽來說，劇烈程度 LiCl ＞ NaCl ＞ KCl。去垢劑的選擇，鹽和去垢劑的濃度都會對 ChIP 效果產生很大影響。很多實驗室或公司在這方面都有自己獨到的 buffer 配方。

最后，除了以上關鍵的兩個因素之外，為了降低背景，很多實驗會在兩個地方做優化：1，在超聲破碎之前，首先破碎胞漿，通過離心將胞漿胞核分離，去除胞漿蛋白，降低胞漿蛋白干擾。2，用超聲后的染色質與 protein A/G beads 預孵育，在去除 beads 之后再加入鮭精 DNA 預封閉過的 protein A/G beads 和目的蛋白抗體進行孵育。（根據個人的經驗，這兩點優化可能能降低背景，但是并不是 ChIP 成功與否的關鍵。當然對于與染色質結合不強的蛋白的 ChIP 或少量的細胞的 ChIP，降低背景就比較必要了）。

相關鏈接：如何判斷 ChIP 實驗是否成功？

Active Motif ChIP 實驗相關產品：

ChIP 抗體

ChIP 試劑盒

磁珠/瓊脂糖珠

其他

參考文獻：

1. Santos-Rosa, H., et al., Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature, 2002. 419(6905): p. 407-11.

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