高分辨率熔解（High-resolution melting，簡稱HRM）分析是一門新興的技術。它僅僅通過PCR之后的熔解曲線分析，就能檢測PCR片段的微小序列差異，從而應用在突變掃描、序列配對和基因分型等多個方面。憑借其速度和簡便性，高分辨率熔解這種方法正在迅速普及。

其實雙鏈DNA的熔解分析可追溯到上世紀六十年代，當時是通過紫外吸收來監測的。分析需要幾微克的DNA，而樣品以0.1-1.0°C/分鐘的速率緩慢加熱，常常要花上幾個小時才能完成。后來，LightCycler定量PCR儀的出現，讓熒光熔解分析變得流行。樣品量因毛細管而縮減至納克級，且熔解速率更快，達0.1-1.0°C/秒，這樣熔解時間縮短至幾分鐘。當時使用的染料是SYBR? Green I。

然而，這種熔解分析只能區分在片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列，比如檢查PCR擴增產物中是否存在引物二聚體及其他非特異性的擴增。如果要區分SNP，分辨率還不夠。為什么呢？

這里有必要先介紹一下飽和染料和非飽和染料。SYBR Green I就屬于非飽和性染料，由于它對PCR的抑制作用，在實驗中的使用濃度很低，遠未將DNA雙螺旋結構中的小溝飽和。這樣，DNA雙鏈高溫變性時，單鏈部分的熒光染料分子發生重排，熒光染料分子重新結合到雙鏈DNA的空置位點，造成熒光信號沒有變化，因此出現假陰性，特異性下降。

于是，飽和染料問世了。為什么稱為飽和染料呢？因為它們即便在飽和濃度（熒光最大）下，也不會抑制PCR。故高濃度的染料飽和了DNA雙螺旋結構中的小溝，在DNA解鏈過程中就不會發生重排，這樣熔解曲線才有了更高的分辨率。目前市場上的飽和染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等幾種。光有染料還不夠，儀器也要相應升級呢。

擴增子的熔解曲線完全取決于DNA堿基序列。序列中如有一個堿基發生了突變，都會改變DNA鏈的解鏈溫度。但是這個差異極小，只有零點幾攝氏度，如果儀器的分辨率不高，是根本無法檢測的。

那么什么樣的分辨率才是高分辨率呢？根據儀器現有的功能測試，在熔解操作時每攝氏度至少要獲得10個數據點，這是對儀器的最低要求。此外，溫度均一性也同樣重要。如果兩孔之間溫度相差0.1°C，就很可能導致最終的熔解溫度相差0.1°C，這樣就無法保證HRM分析結果的準確性。大多數常規定量PCR儀的孔間溫度差在0.3-0.5°C，這也決定了它們無法勝任HRM。

目前市場上有多個廠家提供HRM分析的儀器，包括Idaho Technology、Corbett（QIAGEN）、Roche等，有些是專供HRM的儀器，有些則是附帶HRM功能的定量PCR儀。HRM的發明者—美國猶他大學醫學院的Wittwer實驗室曾評估了市場上多臺儀器在基因分型和突變掃描上的性能1。

他們發現，對于大部分儀器的準確基因分型來說，主要限制在于平板上的空間溫度差異（Tm的標準偏差為0.020-0.264°C）。其它差異如數據密度、信噪比和熔解速率，也會影響雜合體的掃描。經過比較發現，空氣加熱型儀器以及樣品溫度單獨控制的儀器有著更低的Tm標準偏差（0.018-0.065），而加熱塊型儀器則在0.092-0.274。

在擁有飽和染料和高分辨率儀器之后，HRM分析就可以開始啦。這個過程其實很簡單，就是對PCR的擴增子進行加熱，溫度從50°C逐漸上升到95°C。在此過程中，擴增子逐漸解鏈，在到達熔解溫度（Tm）時，DNA鏈完全分開。在HRM分析的初期，熒光強度很高，隨著溫度升高，雙鏈DNA逐漸減少，熒光強度也就下降了。HRM儀器通過照相機，記錄下熒光變化的整個過程。通過對數據的作圖，就生成了熔解曲線。

果然夠簡單吧，連探針也無需設計，只要在常規PCR中加一個飽和染料即可。HRM既可以對未知突變進行篩查、掃描，也可以對已知突變進行分析。相對于傳統的突變分析而言，操作步驟大大簡化，時間和成本也降低了不少。而且樣品經PCR擴增后直接進行HRM分析，無需轉移，真正實現了閉管操作，降低了污染的風險。

正是憑借這些優勢，HRM近年來廣泛用于突變掃描、序列配對、基因分型和甲基化分析等應用中。

序列配對

序列差異分析常用的方法包括單鏈構象多態性、變性梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜、測序等，這些方法都需要分離樣品，之后進行多步反應，操作繁瑣，耗時長，且PCR產物有污染的風險。而HMR在5分鐘之內就能完成，無需額外的步驟，也容易開發成高通量篩選，且是唯一的閉管操作，增加了分析的可靠性，這些優勢對于分子診斷分析而言，格外重要。

在器官移植中，醫生通常會檢測兄弟姐妹的HLA，以便了解主要組織相容性是否匹配。利用PCR產物的熔解曲線，能快速配對HLA序列。與熔解溫度（Tm）不同，那只是熔解曲線上的一個點，高分辨率熔解是分析整個熔解曲線。利用熔解曲線的形狀作為指示劑，來顯示雜合DNA所形成的異源雙鏈的序列匹配。

之后將兩個DNA按1：1的比例混合，重新熔解，并將新曲線與原先的曲線進行比較，來驗證序列的匹配。如果兩個樣品的序列不是完全相同的，那么混合后異源雙鏈的熔解曲線形狀會改變。

瑞典烏普薩拉大學的Olof Gidl?f等曾開發出線粒體基因組中兩個超變區HVI和HVII的HRM分析，以分辨不同個體的DNA，作為法醫鑒定中測序前的預篩選2。

研究結果表明，線粒體DNA中HVI和HVII所存在的序列變異確實產生了熔解曲線形狀的差異，能辨別不同個體的DNA，這樣就能排除不匹配的法醫材料，從而節省線粒體DNA測序的時間和費用。另外，與其它技術相比，HRM操作簡單，價格低，能同時篩選大量的樣本。