外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞后可被修復。

相鄰的5'磷酸和3'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的DNA連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實際上在有克隆用途中，T4噬菌體DNA連接酶都是首選的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端DNA片段連接起來。

DNA一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度完全由互相匹配的DNA末端的濃度決定。不論末端位于同一DNA分子（分子內連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種DNA，也就是用可產生粘端的單個限制酶切割制備的磷酸化載體DNA。在瓜作用的底物。

如果反應中DNA濃度低，則配對的兩個末端同一DNA分子的機會較大（因為DNA分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同DNA分子的末端的概率）。這倦，在DNA濃度低時，質粒DNA重新環化將卓有成效。如果連接反應中DNA濃度有所增高，則在分子內連接反應發生以前，某一個DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA濃度高時，連接反的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。

Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊)從理論上探討了DNA濃度對連接產物性質的影響。簡而言之，環化的連接產物與多聯體連接產物的比取決于兩個參數：j和i。j是DNA分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數值是根據如下一種假設作出的：沉吟液中的DNA呈隨機卷曲。

這樣，j與DNA分子的長度成反比（因為DNA越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對給定長度的DNA分子來說是一個常數，與DNA深度無關。j＝[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA長度，以cm計，b是隨機卷曲的DNA區段的長度。b的值以緩沖液的離子強度為轉移，而后者可影響DNA的剛度。

i是溶液中所有互補末端的深度的測量值，對于具有自身互補粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里No是阿佛伽德羅常數，M是DNA的摩爾濃度（單位：mol/L）。理論上，當j=i時，給定DNA分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。

因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當j>i時，有利于重新環化；當i>j，則有利于產生多聯體。圖1.9顯示了DNA區段的大小與連接反應混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時所需DNA濃度之間關系（Dugaiczyk等，1985）。

現在考慮如下的連接反應混合物：其中除線狀質粒之外，還含有帶匹配末端的外源DNA片段。對于一個給定的連接混合物而言，產生單體環狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的絕對濃度影響， 而且還受質粒和外源DNA末端的相對濃度的影響。

當i是j的2－3倍（即末端的絕對濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時）外源DNA末端濃度的2倍時，有效重組體的產量可達到最大。這些條什下，連接反應終產物的大約40%都是由單體質粒與外源DNA所形成的嵌合體。當連接混合物中線瘃質粒的量恒定（j:i=3）而帶匹配末端的外源DNA的量遞增時，這種嵌合體在連接反應之末的理論產量。

涉及帶粘端的線狀磷酸化質粒DNA的連接反應應包含：

1）足量的載體DNA，以滿足j:i>1和j:i<3。對一個職pUC18一般大小的質粒，這意味著連接反應中應含有載體DNA為20-60μg/ml。

2）未端濃度等于或稍高于載體DNA的外源DNA，如外源DNA濃度比載體低得多，在效連接產物的數量會很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉化菌落。這種情況下，可考慮采用一些步驟來減少帶非重組質粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質粒DNA或發跡克隆策略以便通過定向克隆的方法構建重組質粒。

粘端連接

1）用適當的限制酶消化質粒和外源DNA。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質粒DNA。通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化DNA，然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。

2）按如下所述設立連接反應混合物：

a．將0.1μl載體DNA轉移到無菌微量離心管中，加等摩爾量的外源DNA。

b．加水至7.5μl，于45℃加溫5分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到0℃。

c．加入：10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液 1μl

T4噬菌體NDA連接酶 0.1Weiss單位

5mmol/L ATP 1μl

于16℃溫育1－4小時

10xT4噬菌體DNA連接酶緩沖液

200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)

50mmol/K MgCl2

50mmol/L二硫蘇糖醇

500μg/ml牛血清白蛋白（組分V.Sigma產品）（可用可不用）