cDNA文庫構建的過程分為六個階段：

階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈

階段2：cDNA第二鏈的合成

階段3：cDNA的甲基化

階段4：接頭或銜接子的連接

階段5：Sepharose CL-4B凝膠過濾法分離cDN

階段6：cDNA與λ噬菌體臂的連接 階段1：反轉錄酶催化合成cDNA第一鏈 1.在置于冰上的無菌微量離心管內混合下列試劑進行cDNA第一鏈的合成：

poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl

寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl

1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl

1mol/L KCl 3.5μl

250 mmol/L MgCl2 2μl

dNTP溶液（含4種dNTP，每種5mmol/L） 10μl

0.1 mol/L DTT 2μl

RNase抑制劑（選用） 25單位

加H2O至 48μl

2.當所有反應組在0℃混合后，取出2.5μl反應液轉移到另一個0.5ml微量離心管內。在這個小規模反應管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。

3.大規模和小規模反應管都在37℃溫育1h

4.溫育接近結束時，在含有同位素的小規模反應管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后將反應管轉移到冰上。大規模反應管則在70℃溫育10 min，然后轉移至冰上。

5.參考《分子克隆實驗指南》第三版附錄8所述方法，測定0.5μl小規模反應物中放射性總活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。此外，用合適的DNA分子質量參照物通過堿性瓊脂糖凝膠電泳對小規模反應產物進行分析是值得的。

6.按下述方法計算cDNA第一鏈的合成量（推算方法略）：[摻入的活度值(cpm)/總活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一鏈(μg)

7.盡可能快地進行cDNA合成的下一步驟。