[器材和試劑]

Winard PCR純化試劑盒 （Promega）

PCR試劑和設備

用于連接scFv和pHENl DNA以及將scFv文庫電轉化到大腸桿菌TGl株的試劑和設備 FDSEQ引物

擴增的VHCDR3基因文庫和VL基因，

[方法]

1. 配制4個25ulPCR反應液，包含：

去離子水，10.25ul

10×Vent緩沖液，2.5ul

20×dNTP（每種5mmol/L）， 1.25ul

VH文庫DNA（200ng），l 0ul

VL基因DNA（200ng）， 5.0ul

VentDNA聚合酶（2單位），1.0ul

在有加熱蓋PCR儀中以94℃1.5分鐘、65℃1.5分針、72℃1,5分鐘無擴增循環7次，連接片段。

2. 7次循環后，保持在94℃，添加含有旁側引物的25ul混合液：

去離子水，15.2ul

10×Vent緩沖液，2.5ul

20×dNTP（每種5mmol/L）， 1.3ul

FdSEQ引物 （10pmol/u1）， 2.5ul

LMB3引物（10pmmol/ul），2.5ul

VentDNA聚合酶（2單位），1.0ul

3. 以94℃1分鐘、42℃1分鐘、72℃2分鐘的條件共循環30次，剪接片段。用Wlnard PCR純化試劑盒純化PCR產物。

4. 用NcoI和NotI消化PCR產物。

5. 將消化的PCR產物連接到NcoI/NotI消化的pHENl中，并電轉化到大腸桿菌TGl細胞，用于VHCDR3多樣化的引物定位和設計。

VHCDR3多樣化所需引物是根據擬親和力成熟抗體的V基因序列進行設計的。例中，VHCDR3（下劃線區域）中7個氨甚酸被隨機化。框架3 （FR3）末端和框架4（FR4）起始端用實線標出