質粒DNA的制備

【實驗目的】

1.了解質粒的特性及其在分子生物學研究中的作用；

2.掌握質粒DNA分離和純化的原理；

3.學習堿裂解法和煮沸法分離質粒DNA的方法。

【實驗原理】

質粒是細菌內的共生型遺傳因子，它能在細菌中垂直遺傳并且賦予宿主細胞特定的表型。質粒載體是在天然質粒的基礎上為適應實驗室操作而進行人工構建的。

與天然質粒相比,質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因(如抗生素抗性基因)和一個人工合成的含有多個限制性內切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作。大多質粒載體帶有一些多用途的輔助序列，這些用途包括通過組織化學方法肉眼鑒定重組克隆、產生用于序列測定的單鏈DNA、體外轉錄外源DNA 序列、鑒定片段的插入方向、外源基因的大量表達等。

一個理想的克隆載體大致應有下列一些特性：

（1）分子量小、多拷貝、松馳控制型；

（2）具有多種常用的限制性內切酶的單個酶切位點；

（3）能插入較大的外源DNA 片段；

（4）具有容易操作的檢測表型。常用的質粒載體大小一般在1kb 至10kb 之間，如pBR322、pUC 系列、pGEM 系列和pBluescript（簡稱pBS）等。

經過改造的基因工程質粒是攜帶外源基因進入細菌中擴增或表達的重要媒介，這種基因的運載工具在基因工程中具有極廣泛的用途，而質粒的分離與提取則是基因工程最常用、最基本的實驗技術。

一般分離質粒DNA的方法都包括3個步驟：

①培養細菌，使質粒DNA大量擴增；

②收集和裂解細菌；

③分離和純化質粒DNA。分離制備質粒DNA的方法很多，其中常用的方法有堿裂解法、煮沸法、SDS法和羥基磷灰石層析法等。

在實際操作中可以根據宿主菌株的類型、質粒分子大小、堿基組成和結構等特點以及質粒DNA的用途選擇不同的方法。本實驗介紹最常用的堿裂解法和煮沸法提取質粒DNA。

1. 堿變性法

堿變性法提取質粒DNA是基于染色體DNA與質粒DNA的變性和復性的差異而達到分離的目的。在pH值高達12.6的堿性環境中，染色體的線性DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結構解開而被變性；共價閉環質粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但兩條互補鏈不會完全分離，仍會緊密地結合在一起。

用pH4.8的KAc或NaAc高鹽緩沖液調節其pH值到中性時，因為共價閉合環狀的質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此可以迅速復性；而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，不能復性，它們相互纏繞形成不溶性網狀物，而復性的質粒DNA恢復原來構型，保持可溶性狀態。

通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉淀下來而被除去，用酚-氯仿抽提純化上清液中的質粒DNA，然后用乙醇或異丙醇將溶于上清液中的質粒DNA沉淀。

2.煮沸法

細胞用含有TritonX－100的緩沖液處理，溶解細胞膜。用溶菌酶酶解細菌細胞，

然后在高溫條件下，使細胞裂解，破壞細菌細胞壁，有助于解開DNA鏈的堿基對，并使蛋白質和染色體DNA變性。而閉環質粒DNA配對雖被破壞，但雙鏈彼此不分開，當溫度下降時恢復成超螺旋。變性蛋白帶著染色體DNA一起沉淀下來，質粒DNA仍留在上清液中。離心后的上清液再用異丙醇或乙醇處理，沉淀出質粒DNA。 以上兩種制備方法的實驗過程中，由于細菌裂解后受到剪切力或核酸降解酶的作用，染色體DNA容易被切斷成為各種大小不同的碎片而與質粒DNA共同存在，因此，采用乙醇沉淀法得到的DNA除含有質粒DNA外，還可能有少部分染色體DNA和RNA，必要時可進一步純化。

提取的質粒DNA中會含有RNA，但RNA一般并不干擾進一步實驗，如限制性內切酶消化，亞克隆及連接反應等，因此不必除去。