申海鷹 周元國（第三軍醫大學野戰外科研究所分子生物學中心，重慶400042）

摘要 疾病基因的分離和克隆 是功能學的研究熱點，具體策略的選擇取決于疾病背景資料的掌握程度，為能快速、準確地克隆 出目的基因，本文介紹兩類常用的基因克隆 策略――定位克隆 策略、功能策略――及其主要方法，如：家系連鎖分析、等位基因共占法、人群相關分析法、抑制性消減雜交、差示反轉錄PCR、差異消減顯示法、代表性差異分析法、比較雜交等，并作簡要的評價。

關鍵詞 基因；定位；消減雜交

Strategies and methods for cloning pathogenic gene SHEN Hai-ying, ZHOU Yuan-guo. (Center of Molecular Biology, Research Institute of Surgery and Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042)

Abstract Isolation and cloning of pathogenic gene is a hot spot in functional genome study, while it is the disease background which decides the selection of the strategies. Two strategies, mapping strategy and functional cloning strategy, which can clone the objective gene rapidly and accurately were introduced. Some main methods including family-based linkage analysis, allele sharing method, population association analysis, suppression subtractive hybridization (SSH), differential display reverse-transcription PCR (DD-RT-PCR ), differential subtraction display (DSD), representational difference analysis (RDA), comparative genome hybridization (CEH) were elucidated briefly.

Key words: Gene; Mapping clone; Subtractive hybridization

基因組全序列測定可望提前完成，而以功能鑒定為中心的功能基因組學應運而生，將人類5~10萬個基因定位及克隆 是一項龐大而艱巨的任務。自1911年Wilson將色盲基因定位于X染色體起，隨著連鎖分析方法的發展和體細胞雜交、重組DNA 、分子雜交以及PCR技術的發現和應用，陸續出現了幾種改進或全新的遺傳學基因定位和克隆 方法。與此同時，另一類以消減雜交為基本原理的代表性差異分析、基因組錯配掃描、比較雜交及mRNA 差示等方法的出現和應用，使一些多基因遺傳病相關致病基因的篩查和定位面臨突破。迄今為止，約有5000個遺傳性狀被定位，其中400多個為致病基因［1］。根據不同的背景資料，人類基因可采取的思路有四種。

目前人類基因克隆的主要策略有三種：一是反向遺傳學定位克隆 策略，它通過RFLP、微衛星DNA 等遺傳標記，先獲得某一表型基因在染色體上的定位，再在候選區域內選擇已知基因，進行致病突變的篩選，并獲得cDNA 及全基因；另一類是從蛋白質功能著手的功能克隆 策略，采用以消減雜交為策略的多種分子生物學手段，先通過消減獲得特異表達或缺失的基因片段，然后進行染色體定位乃至獲得全基因。本文擬就前兩種主要策略和各自方法的優缺點作一介紹和分析。此外，尚有介于兩者之間的候選克隆 策略，包括定位候選克隆 和功能候選，前者是在將疾病基因以連鎖分析和染色體分析基本定位以后，再在候選區域內選擇所有已知基因進行致病突變的篩選。后者是根據致病基因的可能功能，檢測Genbank中的基因功能區域，將含有接近功能域的基因用于致病的突變檢測。

1. 定位（positional cloning）策略

其基本思路是通過連鎖分析（linkage analysis）原理進行基因定位。若多態標記與待定基因距離較遠，則它們在向子代傳遞時會發生自由分離，呈“連鎖平衡”；反之，則不發生自由分離，而呈現“共分離（co segregation）”現象，即“連鎖不平衡”。據此可在染色體上定位與某一DNA 標記相連鎖的基因。兩基因間連鎖程度以遺傳距離表示：1厘摩(cM)=1%重組率，即1000kb。DNA 標記的選擇經歷了從致病基因→ABO、HLA多態位點→RFLP→微衛星DNA 的發展過程。微衛星DNA （microsatellite DNA ），是一種遍布于真核的短重復序列、長度2~10bp之間、按孟德爾方式遺傳、呈高度多態，能進行PCR擴增。除DNA 標記的進展外，基因定位也得益于連鎖分析方法和理論的改進，目前主要有：家系連鎖分析、等位基因共占法及人群相關性分析等。

1.1家系連鎖分析（family-based linkage analysis）法

是以二代或二代以上的家系材料為基礎，觀察標記位點與疾病致病基因位點在家系內是否呈共分離，并計算出遺傳距離及連鎖程度。目前最常用的方法是優勢對數計分（Lods）法，Lod值代表兩位點連鎖的機率與不呈連鎖的機率比的對數值，>3肯定連鎖，<－2否定連鎖，介于1與－2之間則需增加家系材料。該法優點在于對連鎖的判斷能力強，能確定連鎖程度，適于呈孟德爾遺傳、外顯率高、純一的單基因突變病分析［2］，如糖尿病中的一種亞型MODY及少數呈多代多發患者的IDDM及NIDDM家系。缺點是需要完整的系譜材料，結果受遺傳模型設定的影響，對遺傳參數如基因頻率、基因傳遞率、外顯率及表型模擬率等依賴較大，故對一些復雜多基因疾病進行家系連鎖分析很難獲得滿意結果［3］。