一、 實驗原理

核酸分子（DNA或RNA）由于含有嘌吟環和嘧啶環的共軛雙鍵，在260 nm波長處有特異的紫外吸收峰，其吸收強度與核酸的濃度成正比，這個物理特性為測定核酸溶液濃度提供了基礎。

1 OD260相當于dsDNA 50 ug/ml，ssDNA 33 ug/ml和ssRNA 40 ug/ml。可以此來計算核酸樣品的濃度。

紫外分光光度法不但能確定核酸的濃度，還可通過測定260nm和280nm的紫外線吸收值的比值（A260/A280）估計核酸的純度，純的DNA制品的比值為1.8，RNA的比值為2.0， 若DNA高于1.8，則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質污染。

對于很稀的核酸溶液，可用熒光光度法進行測定。DNA 本身并不產生熒光，但在熒光染料溴化乙錠（EB）插入DNA 的堿基對平面之間并與之結合后，DNA樣品能在紫外光的激發下產生桔紅色熒光。熒光強度與被結合的EB的量成正比，而被結合的EB的量又與核酸分子長度和含量成正比，使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液的濃度。靈敏度可達1~5ng。由于是基于目測，所以是估計水平。 該方法經濟簡便，但準確性較低。

二、儀器及試劑

1. 儀器：Amersham GeneQantTM Pro 紫外可見分光光度儀，瓊脂糖凝膠電泳設備。

2. 試劑及配制：

5×上樣緩沖液：配制10 ml0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 2 ml10% SDS 50 ul50% 甘油 2.5 ml0.2% 溴酚藍 10 mg0.2% 二甲苯青FF 10 mg加去離子水至10 ml

其它試劑：0.1×TE 、DNA標準液，EB儲存液（10 mg/ml），

三、實驗步驟

1.紫外分光光度法

（1）用0.1×TE對待測DNA樣品按1：20或合適的倍數稀釋。

（2）開機，儀器會自動對光路及分析軟件進行檢測，待顯示屏上出現“instrument Ready”時，進入核酸測定窗口

（3）調零。先用0.1×TE緩沖液注入樣品杯，放入樣品槽，關閉蓋板。點擊“set ref”鍵，儀器自動校正零點。將樣品槽內的樣品杯取出，換上待測樣品。

（4）吸70 ul已稀釋的DNA樣品轉入石英樣品杯，放入樣品槽，關閉蓋板。如果樣品很少，可以用5~7ul的石英樣品杯。點擊“enter” 鍵，儀器即進入分析狀態。窗口同時顯示260和280nm處的光密度（OD值）及260/280nm和280/260nm的比率以及DNA樣品的濃度等。

（5）打開蓋板，取出石英樣品杯，吸出樣液，用高純水清潔石英樣品杯，風干后，再加入下一個待測樣品。

（6）DNA純度：以OD260/ OD280比值來反映。當OD60 /OD80比值 <1.8時，說明樣品存在蛋白質或酚等雜質，可采用平衡酚/氯仿/異戊醇再抽提除去蛋白質或用乙醚抽提去除殘留酚，再用無水乙醇沉淀，TE懸浮后再測定。當OD60/OD280比值>2.0，說明樣品存在RNA污染，可以用RNA酶處理樣品去處RNA 。