Double-tag在蛋白純化過程中的應用 ? ?? ? ? ?? ?? ?? ? ? ?? ?Protein表達是一個非常復雜的過程，因此很難預測表達的蛋白是否是可溶性的、包涵體形式還是部分降解的。為了預防各種可能的困難條件，在重組蛋白上導入兩種Tag可以提供獲得高純度均質蛋白的靈活性。 ? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? ? ?? ?蛋白含有兩種不同親和純化Tag的重要原因： ? ?? ???純化全長的蛋白 ? ?? ???獲得最高純化的蛋白 ? ?? ???適合變性或生理條件下純化 ? ?? ???優化的操作過程，可以直接從培養基中純化蛋白 ? ???與Strep-tag®配合最有效的是6xHistidine-tag，總之推薦一個Tag在蛋白的N-端，另外一個Tag在蛋白的C-端。 ? ?? ? ? ?? ?純化全長蛋白： ? ?? ?? ?? ? ? ?? ?重組的蛋白在表達時會有部分降解，即使在下游的處理過程中加入蛋白酶抑制劑也無法避免。可溶性降解蛋白仍然帶有純化tag，在純化時會引起純化蛋白的不純（由于有不同長度片段的蛋白混入）。這種問題可以通過在蛋白的另一端加入第二種Tag來解決。經過第二種Tag的純化，即可獲得全長的蛋白。 ? ?? ? ? ?? ?最高純度的蛋白： ? ?? ?? ?? ? ? ?? ?在生理條件下，Strep-tag純化可以將重組蛋白的純化提升到約99％。由于重組蛋白特性不同，純化的高低也有差異。盡管可以通過更改純化樹脂來解決該問題，但是采用第二種純化Tag是目前最有限的方法。尤其對于結晶學研究、免疫和高通量分析，高純度蛋白的獲得非常重要。 ? ?? ? ? ?? ?適合變性或生理條件下純化： ? ?? ?? ?? ? ? ?? ?很難預測表達的重組蛋白是可溶性還是形成包涵體，這由啟動子的強度和蛋白自身的折疊速率所決定。如果蛋白是可溶性的并具有生理功能，Strep-tag是純化的最佳選擇，因為其可以在生理條件下純化蛋白從而保持蛋白的生物學活性。如果蛋白以包涵體形式存在，需要加入高濃度的胍鹽或尿素使之變性成為可溶以便親和純化。在此變性條件下，可以借用6xHistidine-tag的金屬鰲合活性分離蛋白。采用Ni-NTA 柱，蛋白還可以重新折疊。如果由必要，可借用Strep-tag在生理條件下純化重新折疊的蛋白。 ? ?? ? 直接從培養基中純化蛋白： ? ?? ?? ?? ? ? ?? ?對于高表達的載體(如：昆蟲細胞)，重組蛋白分別到培養基中是經常采用的表達策略。在此情況下，推薦先采用6xHistidine-tag進行第一步的收集。由于6xHistidine-tag對Ni-NTA ? ?? ?matrix具有極高的親和能力，通過分批純化，重組蛋白可以高效收集。作為陽性負對照，生物素與Strep-tag純化系統不兼容，其通常存在于培養基中，經過6xHistidine-tag的收集，生物素可以除去。如果由必要，可以采用Strep-tag作為第二步純化以獲得更高純度的蛋白。