GST融合蛋白純化方法

GST融合蛋白純化方法

1 目的片段接入pGEX載體；

2 涂板，挑單克隆，搖菌至OD600≈1.0，加入IPTG（終濃度1 mM）誘導6－8 h；

3 收菌，每升菌液約以50 mL PBS重懸，加入1%Triton X-100（v/v），1％β-巰基乙醇（v/v），PMSF（終濃度1 mM）；

以下步驟均在冰上操作：

4 超聲破碎菌體，15000 g，10min離心取上清，在上清中加入適量GST-beads，輕輕晃動令其吸附蛋白1 h；

5 2000 g，3min離心棄上清；

6 加入至少10倍體積PBS，輕搖至beads懸浮于溶液中，2000 g，3 min離心棄上清；

7 重復步驟6 兩次；

8 加入1 mL GST Elution Buffer，輕搖10 min；

9 2000 g，3 min離心，收集上清；

10 重復步驟8-9至少兩次；

11 SDS-PAGE電泳檢測蛋白純度，Bradford法檢測蛋白濃度；

12 將蛋白置于-20℃保存。

P.S. 大量提取前應取少量菌液，改變IPTG濃度，誘導溫度，誘導時間等，以確定蛋白表達的最適條件。