加、減、換一個載體 的MCS的位點 （給一個表達 載體加、減、換小表達標簽，如His6， His10，strep II等，和MCS改造是一樣的），其實技術 不是問題，問題在于位點的選擇 ，因為載體設計 時應該設計者也考慮過mcs的問題，應該給使用者越多的選擇越好，但為什么有的載體只給有限的幾個位點呢，一可能是這個載體其他部位本身含有的限制性切點比較多，因而MCS位置的選擇比較少，二就是設計者是自用的載體，沒有考慮到我們的感受 。

　　因此如果你要加、減、換MCS，可以按一下幾個步驟進行：

　　1、找到載體全序列 ，查找有沒有你想要加的位點（Primer premier5……一堆軟件 ，再不濟了用word），如果沒找到你想加、減、換的位點，恭喜了，革命要成功了；

　　2、方法上不太推薦點突變或其他以overlap PCR 為基礎的技術，推薦小片段 克隆 ，也就是做shRNA 載體的那種方法，人工合成（按引物 合成）你想要的MCS序列的正反鏈，兩端加上載體上兩個切點的粘末端序列，人工退火（95度10min，然后每分鐘降5度直至Tm值下5度，維持10min，即可），不用電泳檢驗，直接按克隆的連接體系將這個小片段與你的載體（相應酶雙切）連接轉化……

　　小片段連入的效率相當高，如果大家要檢驗：在菌長出來后，做PCR檢驗（人工合成的這個小片段的正鏈或反鏈與載體上的引物）。舉個例子：

　　比如要在某載體的EcoR I和BamH I之間加一個新的MCS（EcoR V－Kpn I－Xho I－Hind III）（這幾個位點必須在目的 載體上沒有，如果有這個切點，你又實在想用的話，可以將目的載體用這個酶單切，綠豆芽核酸 酶/s1核酸酶平端化，再自連——位點封閉）：

　　1、合成 5‘－AATTC GATATC NNN GGTACC NNN CTCGAG NNN AAGCTT G -3'

　　3'－ G CTATAG NNN CCATGG NNN GAGCTC NNN TTCGAA CC TA G-5'

　　EcoR I粘末端 EcoRV Kpn I Xho I Hind III BamH I粘末端 ； （這里面有幾個要點，合成時直接合成粘末端，省得再切，這樣既省合成的錢，效率又高，如果你需要在改造后的載體繼續使用原載體的連入切點，比如上面例子的EcoR I和BamH I，你像例子中一樣可以合成完整的酶切位點粘末端，如果你不想使用它們，那就只合成粘末端，比如上面那個例子，應合成5-AATT GATATC ……和3’-CTATAG ……這樣連接后，EcoR I切點就被封閉了；再有要注意考慮連入位點之間要留一定的間隔，因為靠著的兩個酶是很難雙切開的，有時候分步切都沒用，因為留給酶結合的空間太小，沒法結合l ，一般按照相鄰兩個酶的推薦保護堿基數中較大的數目留，萬無一失啊）

　　2、退火，如上；

　　3、克隆，同上；

　　4、檢驗，同上。測序，收工。