1、引物設計：每條引物都要攜帶有所需的突變位點，引物一般長25~45bp,設計的突變位點需位于引物中部。

　　2、反應：使用高保真的pyrobest DNA聚合酶 ；循環次數少，一般為12個循環。

　　反應體系：

　　10x pyrobest Buffer 5 ul

　　dNTP Mixture(10mM) 1ul

　　模板DNA(5~50ng) 1ul

　　primer 1 (125ng) 1ul

　　primer 2 (125ng) 1ul

　　pyrobest DNA polymerase（TaKaRa）(5U/ul) 0.25ul

　　加無菌蒸餾水至 50ul

　　3、產物沉淀純化：加1/10 體積的醋酸鈉，1倍體積的異丙醇，混勻置冰上（或-20゜C冰箱）5min,離心棄上清，70~75%乙醇洗鹽兩次，烘干后溶于無菌水中。（此步可省略，直接用 DpnI酶切）

　　4、DpnI酶切：Buffer 2ul

　　BSA（100╳） 0.2ul

　　DNA x ul

　　DpnI 0.5ul

　　加無菌去離子水至 20ul

　　30゜C酶切 1~4 h ；65゜C 水浴15min 終止反應。

　　5、將酶切產物轉化大腸桿菌DH5a菌株，利用抗生素篩選突變子。

　　6、測序驗證