染色質免疫沉淀 (ChIP) 用于檢測細胞核中天然染色質內的蛋白質與?DNA?之間的相互作用。ChIP 實驗首先需要將細胞固定，即將蛋白質與 DNA 相互作用交聯固定到位。然后將染色質打斷為片段，使用抗體對目的蛋白質以及與其結合的所有 DNA 進行免疫沉淀。最后，解交聯，對沉淀 DNA 進行純化。純化的 DNA 可進行進一步的分析，如標準或實時?PCR、芯片或測序分析。這些實驗對染色質的完整性、蛋白質表位的質量以及免疫沉淀抗體的特異性非常敏感。尤其當目標蛋白質與 DNA 相互作用極少發生或不穩定時，這些變量就更為關鍵。第 1 步 – 采用對照（實驗嚴謹更可靠）雖然使用酶消化制備染色質，可以改善 ChIP 操作規程，但合理的對照和高度特異性的抗體也同樣重要。在實驗操作步驟中添加陽性和陰性對照抗體可確保分析正常進行且結果可靠。陽性對照許多市售的試劑盒附帶 Rpb1（RNA 聚合酶 II 的最大亞基）的抗體，做為陽性對照抗體。但是，Rpb1 僅在活性轉錄位點結合，因此，如果要研究的位點是非活性位點，那么 Rpb1 實際上將作為陰性對照使用。CST 推薦使用 Histone H3 (D2B12) XP? Rabbit mAb (ChIP Formulated) #4620。該抗體可檢測與基因組中所有 DNA 序列結合的所有組蛋白 H3 類型（H3、H3.3、CENP-A）。因此，不管檢測的位點活性狀態如何，該抗體都能為 ChIP 實驗提供通用的陽性對照。陰性對照陰性對照抗體（如正常兔 IgG）不能識別特異抗原表位，因此可用于檢測非特異性結合。例如，如果陰性對照樣品中的產物量等于特異靶標樣品中產物量，那么可得出結論，特異靶標抗體出現非特異結合或本底水平的信號。這個結果結合陽性組蛋白 H3 信號，表明您的染色質斷裂不充分且您的特異靶標抗體未發揮作用。

第 2 步：染色質制備（做好準備工作）– 即使是最好的抗體也無法 pull-down 不存在的東西許多實驗室使用超聲處理來制備用于免疫沉淀的染色質。雖然效果不錯，但超聲處理需要將染色質暴露于容易導致蛋白變性的惡劣條件中（比如高熱和去污劑），這些條件可能會同時破壞抗體抗原表位和基因組 DNA。此外，超聲處理條件穩定性較差。制備的方法和質量將視所使用超聲儀的類型和品牌，以及所使用的超聲儀探頭的狀況而變化。此外，染色質處理不足與處理過度之間可能僅有數秒差異。因此，使用該方法難以生成均一大小的染色質片段樣品。高頻率、非常穩定的蛋白質與 DNA 相互作用（如組蛋白與 DNA 之間的相互作用），發生頻率之高，即使操作流程并不完善也常能被檢測到。如果操作規程不能確保蛋白質和 DNA 的完整性，或者使用了對靶標不具有高度特異性的抗體，則低頻率且較不穩定的相互作用（比如多梳蛋白與特定基因 [例如 Ezh2] 的結合）就可能會低于檢測閾值。相比之下，酶消化方法使用微球菌核酸酶切入染色質核小體之間的連接區域，柔和地把染色質剪切成均一片段。酶消化無需高熱或去污劑，且如果使用與細胞數量成比例的酶用量，還可得到一致的結果。因此，酶消化方法更易于控制，可避免抗原表位和 DNA 被剪切或變性，且得到的一致、高品質的染色質樣品還有利于免疫沉淀。下方顯示的實驗分別使用 SimpleChIP? Plus Enzymatic Chromatin IP Kit (Magnetic Beads) #9005 和另一家公司的基于超聲處理的試劑盒進行。首先采用酶消化（依照 SimpleChIP 試劑盒使用說明）或超聲處理（依照其他公司的試劑盒使用說明）來處理染色質樣品。然后，分別使用來自 SimpleChIP? 或其他公司試劑盒的免疫沉淀試劑，使染色質與指定的一組抗體進行免疫沉淀。通過實時?PCR?對免疫沉淀的 DNA 進行定量，以占總染色質 input 量的百分比來表示。與超聲處理制備的染色質相比，酶消化制備的染色質顯示靶標 DNA 位點的富集度更高，不管使用的是另一家公司的免疫沉淀試劑盒還是 SimpleChIP? 試劑盒，結果均是如此。在分析穩定性較低的相互作用，比如 polycomb 蛋白（Ezh2 [D] 或 SUZ12 [E]）與特定基因的結合時，這一點尤其明顯。

第 3 步 - 選擇抗體非高度特異的靶標抗體可能會出現不可預見的結合并增加背景信號，從而增加檢測低豐度或低穩定性相互作用的難度。您的抗體應該滿足以下標準：靶標特異性：

• 抗體應與陽性/陰性對照細胞系、敲除細胞或經過 siRNA 處理的細胞中預期表達一致。

• 抗體應檢測酶類特異活化劑和/或抑制劑處理后有相應表達。

• 應使用肽陣列或肽 ELISA 來驗證修飾特異組蛋白抗體的特異性。

可接受的信噪比：

• 應使用同型對照評估信噪比。

• 如實時 PCR 分析所示，已知靶標基因的富集度應至少達到 10 倍本底水平以上。

抗體的質量不是決定免疫沉淀結果的唯一因素；抗體的濃度也會對結果造成重大影響。如果抗體濃度相對染色質的量過高，其可能會使分析過度飽和，導致特異信號降低和/或背景增加。相反，如果抗體的濃度過低，則不能與IP樣品中的所有靶標蛋白質完全結合，導致免疫沉淀效率降低。

CST 提供的 ChIP 級抗體均根據上述標準進行檢測，每個抗體都有推薦的開始濃度。但是，如果您所用抗體來自其他供應商，本指南也可幫助您確保抗體按照您所預期的方式發揮作用。第 4 步 – 下游分析DNA 經過免疫沉淀處理后，即可進行純化，以便進行后續結果分析。有若干種方法可用于分析與特定蛋白質靶標一起免疫沉淀的純化 DNA。我們將在下文描述兩種最常使用的方法。實時 PCR可使用標準或實時定量 PCR 方法對純化 DNA 進行分析。免疫富集的純化 DNA 的 PCR 分析，可幫助用戶在不同生物條件下分析特定的特異蛋白質-基因相互作用。這些實驗需要使用特定區域具有目的引物，因此富集數據局限于被擴增的小片段的基因位點。可使用實時 PCR 儀器附帶的軟件對 PCR 結果進行分析。或者，可使用以下所示的公式手動計算 IP 效率，該公式顯示信號為占總染色質 input 量的百分比。

二代測序分析 (NGS)二代測序分析 (NGS) 可用來在 ChIP 之后使用操作流程中所述的 ChIP 測序對免疫沉淀的 DNA 進行分析。ChIP 測序分析為用戶提供蛋白質/DNA 相互作用的高分辨率基因組范圍內的視圖，這是實時 PCR 分析無法實現的。例如，在以下實驗中，使用活性組蛋白標記物 H3K4me3、非活性組蛋白標記 H3K27me3 和 polycomb 家族轉錄因子 Ezh2（多結合在 H3K27me3 標記的基因區段）的抗體分別進行 IP。已知 Ezh2 與 HoxA 基因簇結合，但不與 GAPDH 基因結合，通過實時 PCR 和下一代測序分析如下所示。(I)

重要的是，實時 PCR 方法僅可對預先選擇的基因組位點進行檢測，而 NGS 可讓研究者獲得基因組上 H3K4me3 和 H3K27me3 標記物和 Ezh2 結合位點的概況。使用該方法獲得的信息量很大，ChIP 測序分析因此成為一種適合研究正常發育過程中或病理狀態下發生的表觀遺傳變化的強大工具。