前兩天做了一個western blot,現在把試驗中的一點小小的體會發上來，與大家交流，希望大家多多指點！ 1 本實驗室采用的脫脂奶粉已經存放了近兩年了，雖然是四攝氏度保存，但是其封閉質量還是難以保證的。所以本人的試驗結果中出現了小斑點。建議最好使用BSA或專用的脫脂奶粉進行封閉，雖然貴點，但還是有個好點的結果比較好。 2 本人采用的是過夜封閉方法，雖然時間長，想想封閉效果應該是沒有什么問題，但是一定要注意封閉液是否蓋過了全部的膜，不要漏掉任何一個小角落喲。 3 洗膜的時候，最好將膜放在平皿中，置于水平的試驗桌面上，不時用手晃動一下平皿，這樣洗膜會比在脫色搖床上更完全。因為在脫色搖床上晃動，有時洗滌液不足以完全沒過膜，在最后顯色的時候，會發現液體流過的一道道痕跡，使背景值增加。 4 其實在western blot中，以上操作都是小問題，最主要的是一抗的質量和待檢測蛋白的提取質量。在試驗之前，最好先用陽性對照與一抗做免疫學沉淀檢測（如ELISA），看看其效價和質量，以便確定在后來的雜交試驗中一抗的選擇和加量。另外，在做雜交之前最好也先跑一塊PAGE膠，染色，檢測一下待檢蛋白的提取質量。 5 在加一抗溫育之前，最好先將等量的一抗與野生型（即陰性對照）的蛋白在37攝氏度作用30分鐘，這樣可以封閉掉一抗的一些非特異性結合位點。 6 一定不要忘記做陰性對照和陽性對照，特別是陰性對照，不然結果出了什么問題，就無從分析了。 7 全程做下來，最后的顯色就像是個一錘定音的時刻，分外激動，但也應該尤為專注，一旦目的條帶出現了，就要馬上對顯色進行終止，要不然雜帶就要出來了。

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