親和層析技術研究進展

親和層析(Affinity Chromatography，AC)是利用偶聯親和配基的親和吸附介質為固定相親和吸附目標產物，使目標產物得到分離純化的液相層析法。親和層析已經廣泛應用于生物分子的分離和純化，如結合蛋白、酶、抑制劑、抗原、抗體、激素、激素素受體、糖蛋白、核酸及多糖類等;也可以用于分離細胞、細胞器、病毒等。

親和層析技術的最大優點在于.利用它可以從粗提物中經過一些簡單的處理便可得到所需的高純度活性物質。利用親和層析技術成功地分離了單克隆抗體、人生長因子、細胞分裂素、激素、血液凝固因子、纖維蛋白溶酶、促紅細胞生長素等產品，親和層析技術是目前分離純化藥物蛋白等生物大分子最重要的方法之一。

近幾十年來，親和層析技術發展十分迅速。對于那些分離流程長、濃度低、雜質多、采用常規方法難以進行分離的生物分子來說，親相層析技術就顯示出其獨特的優越性。親和層析在分離、純化的效率上可以說是最重要的方法之一。

本文講述了親和層析的技術要點，介紹了免疫親和層析、金屬離子親和層析等主要的親和層析方法，還介紹了各種親和層析聯用技術。

1 親和層析的一般問題

1.1 配基的選擇

將一對能可逆結合和解離生物分子的一方與水不溶載體相偶聯制成親和吸附劑，這樣一對生物分子中，被偶聯的一方就叫作配基。在實際工作中，究競選擇哪一種物質作配基，要根據分離對象和實驗的具體情況而定。純化酶選擇酶的競爭性抑制劑、底物、輔酶和效應劑作配基。純化酶的抑制劑選擇相應的酶做配基。純化能結合維生素的蛋白質，選擇與其專一結合的維生素做配基。純化激素受體蛋白，選擇相應的激素做配基，純化核酸可以根據核酸與蛋白質的相互作用、脫氧核糖核酸分子中不同互補鏈之間、DNA和R14A之間雜合作用的關系選擇合適的配基。

1.2 載體的選擇

將親和配基共價偶聯在固體粒子的表面(或孔內)即可制備親和吸附介質，該固體粒子通常稱為配基的載體。因此，親和吸附介質又稱親和載體。作為載體的固體粒子應滿足下列要求:(1)具有親水性多孔結構，無非特異性吸附，比表面積大;(2)物理

和化學穩定性高，有較高的機械強度，使用壽命長;(3)含有可活化的反應基團，用于親和配基的固定化;(4)粒徑均一的球形粒子。常用的親和層析載體有:瓊脂糖凝膠和交聯瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺—瓊脂糖凝膠、纖維素、多孔玻璃等。其它用于載體的物質還有:聚苯乙烯、淀粉珠、殼聚糖、硅膠等。

1.3 基質活化和偶聯

大部份基質在偶聯抗體之前，均需要進行化學活化。活化基質通常經過與抗體表面殘基的—NH反應將抗體偶聯，偶聯反應也可通過與抗體表面的一0H、一C00H或一NH進行。

在小配體的親和色譜中，間隔臂常插在基質和配體之間，以盡量減少空間位阻對蛋白質與其配體相互作用的影響。當配體本身就是蛋白質大分子，因此，空間位阻將不會阻礙抗體與抗原的相互作用。

最常使用的基質活化方法是溴化氰法。用溴化氰活化多糖類基質具有簡單、效果好的特點。許多活化好的、穩定的基質已商品化，在僅僅需要少量基質時可以購買。如果基質的需要量大，自己進行活化更為經濟。

1.4 洗脫問題

洗脫親和吸附劑上吸附的物質大多采用非特異洗脫的方法，通過改變洗脫液的PH值、離子強度、離子種類或溫度等理化性質使固定化配基和生物高分子之間的親和力降低，以至解開生物高分子和親和吸附劑之間的結合。假如那些純化對象和親和吸附劑的親和力不強，當連續通過大體積的平衡緩沖液時，便可在緊隨雜蛋白洗出蜂后，得到純化對象的組分。對于那些吸附得比較牢固的大分子，必須用較強的酸或堿作為洗脫液。也可以用特異洗脫的方法，利用含有與親和配基或目標產物具有親和作用的小分子化合物溶液為洗脫劑，通過與親和配基或目標產物的競爭性結合，脫附目標產物。另一種洗脫的方法是利用配基通過重氮鍵或硫脂鍵連接在載體上的這一特點，當吸附生物大分子以后，可以用還原劑斷裂重氮鍵或斷裂硫脂鍵，從而得到生物大分子和配基的絡合物，然后將絡合物解離，再分出欲純化的生物大分子。

2 免疫親和層析

抗原和抗體的作用具有高度的專一性，并且它們的結合親和力極強。因此用適當的方法將抗原或抗體結合到層析劑上，便可有效的分離和純化各自互補的免疫物質。

2.1 抗體的純化

抗體在親和層析試劑中所占地位日趨重要，所以純化抗體的方法也倍受關注。抗體通常是從血清、雜交瘤上清或腹水中獲得。

2.2 抗原的純化

在蛋白質純化中用抗體親和純化抗原是非常有效的方法。一般純化倍數可達到1000~10000倍。如果抗體與目的蛋白的結合的特異性得到證明，并且經過洗脫的目的蛋白沒有受到可逆的損傷，那么抗體親和純化將是理想的蛋白質純化方法。

抗體親和純化的質量很大程度上取決于抗體溶液的純度，制備親和柱的抗體既要良好的特異性和活性，又要盡可能的純。抗體親和柱的制備是相當昂貴的，其結合容量卻相對較低。因此為了節省和提高效率，經常制備的是小而粗的柱子，同時在親和純化步驟里要求樣品溶液重復幾次上樣，以便純化更多的抗原蛋白。此外，較小的柱子也可以減少和限制柱污染和抗體丟失。

2.3 應用舉例

免疫親和色譜在實驗室被廣泛用于蛋白質的分離純化，目前IAC在治療產品大規模生產上的應用受到價格、配體的滲漏和IAC吸附劑抗原結合容量低等問題的限制。

單抗問世后、不少生物技術公司在研制適宜于培養雜交瘤細胞的生物反應器及其培養基，這些大規模生產單抗技術的建立和不斷完善將降低IAC吸附劑的價格。

隨著新的合成基質和偶聯化合物的出現以及對IAC研究的深人，必將使免疫親和色譜在工業性生產純化蛋白質的應用逐漸得到發展。