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WB實戰指南+正確使用Quantity One定量
| 首先，擺擺自己的經驗。鄙人做WB有8、9年了，平均下來兩天跑一張多的蛋白膠；文章嘛，湊數的單篇有上24+，一作單篇15+（系國內完成；注：當年的IF，現在逐年遞減沒個標準）。 其次，由于一些機緣的因素，在實驗室WB體系完善的過程中，很多靠自己摸索；說實話，碰了一鼻子灰，差不多能碰到的問題都經歷了，因此我敢寫這樣一個咚咚給大家分享。 再次，我再強調一點，對我們這類人來說，實驗結果的可靠、漂亮已經不算一個要求；如何縮短操作時間，使實驗進行的更有效率也是我們所追求的，因此本文會針對兩個普遍采用的卻可以看成浪費時間的操作，Bradford法蛋白定量和立春紅染膜做專門批判，這在以前的WB操作指南是絕無的，甚至叛離被視為經典的分子克隆。——可是，請記住，經典是人定的。 話不多廢，開始： 樣品制備： 變性條件——SDS LB直接裂解：用常溫或者高溫預熱過（預熱更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遺忘，LB久煮某些性質會改變）的1*SDS LB（或者略高1.5*）直接加到細胞或者組織上并煮樣。通常6孔板細胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面積比類推。通常條件下，SDS LB都是過量的（因此不一定要嚴格參考SDS LB稀釋比）；如果SDS LB不夠，樣品核酸、蛋白濃度過高時，煮樣后會發現tip吸不上來，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip。 這時候常規做法有兩種，1. 再煮5min。常規煮樣時間3-5min，樣品過濃時就煮10min；2.如果10min煮樣后，仍然吸不起來，才適當增加SDS LB，繼續煮；也可以對樣品進行超聲。煮樣時間若過長，蛋白會凝固，此時以失去繼續WB的意義，請丟棄（判斷標準：出現明顯的蛋白沉淀和水分層） 此方法的缺點，SDS LB煮過的樣品如果用來做IP，需要特殊方法，因此，這種制備方法制備的樣品有使用局限。非變性裂解法（不討論諸如核抽提、亞細胞器分離等等了，其實類似） 裂解細胞請盡量冰上操作，減緩酶解作用。 俺前boss nature文章上的裂解液配方是：20mM Tris/HCl, pH7.6, 100mM NaCl, 20mM KCl, 1.5mM MgCl2, 0.5% NP-40 and protease inhibitors (20μg/ml leupeptin, 10μg/ml pepstatin A and 10 μg/ml aprotinin)（此裂解液可用于抽提核蛋白），其中蛋白酶抑制劑很復雜也很貴，其實用0.5mM PMSF替代這三種就好了；如果還要做磷酸化蛋白，加1mM Na3VO4（現加現用），10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 50 mM beta-GP。 此方法的優點：NaCl濃度略低于生理狀態，保證裂解細胞的方式較為溫和，便于隨后的IP等試驗。其他Na鹽濃度的細胞裂解液也很常見，諸如0.15M（生理鹽濃度）、0.3M、0.6M（高鹽系列，裂解細胞時染色體會析出，細胞碎片和沉淀非常粘稠）及0.8-1.2M；0.3M及以下適合IP試驗，0.6M及以上適合純化蛋白，尤其相互作用較強的復合體，要得到純化的一些復合體的組成蛋白一般采用極端的高鹽裂解細胞。 用于核蛋白的裂解的原因是0.5% NP-40，用于破壞核膜結構；可用到1%，但此時染色體會析出，沉淀粘稠。 組織塊裂解： 組織塊較大用勻漿的方法最合適，現在有不少轉頭很小的勻漿器。 當組織超微量的時候，比如50mg新鮮癌組織，我采用的方法是 1. 低溫（剪）攪碎，成肉糜狀。 2. 錫箔紙包裹好，放入少量液氮，快速敲擊（控制力量，盡量避免弄破錫箔紙），進一步破碎；反復多次。 3. 用上述細胞裂解液回收。 分泌型蛋白富集：用無血清培養基培養細胞，收集上清液用于WB檢測；如果含量過低，需要用TCA沉淀富集。 理論上，從普通培養基中收集分泌蛋白，此時對細胞生長條件的影響最小，是最佳的實驗條件；但是這存在隱憂。因為含血清的培養基中含有非常豐富的BSA（牛血清白蛋白）之類的蛋白質，除非你進一步分離純化，否則直接用這種樣品去WB會有非常大的麻煩，尤其當你的蛋白在60-46 kDa之間的時候；用“任何”抗體去檢測這一區間的蛋白，會有一片非常強的信號。因為此區間蛋白（主要是BSA）濃度過于富***非特異性粘附“任意”抗體，從而最終被識別。同理，采用SDS LB裂解細胞制備樣品前，通常要用PBS洗滌，其目的之一是去除培養基中的BSA。 采用無血清培養基收集細胞上清除了改變細胞的生理狀態外（可能激活未知信號途徑，諸如AKT等），還會出現的問題是： 1. 即使采用了無血清收集上清，仍然有大量雜蛋白，但相對好很多。 2. 選用了上清，由于蛋白濃度太稀，通常要采用TCA沉淀富集，再重新溶解。 a. TCA沉淀對半定量操作要求非常高，因為很容易沉淀不充分或者離心操作丟失，尤其在離心過程，離心管的擺放非常講究，要180度翻轉離心兩次。 b。重新溶解時，由于蛋白需要在一定的鹽離子條件下才能重新溶解，你要摸索充分溶解的條件，相對麻煩。 實際上，如果你不是非常強調蛋白的分泌有什么生理功能，一般不建議檢測上清，尤其半定量的WB實驗檢測不同樣品間的差異。這里面有實驗操作細節的麻煩——經驗之談，我曾經參與的cancer cell文章所研究的蛋白就是分泌型蛋白，但90%的數據是cell lysis；偶爾用到上清，也只是作為富集純化該蛋白的原料，為進一步分析做準備。 樣品制備完，應立即低溫保存（-20度短期（幾天）；-80度長期；例外，IP用樣品應直接進行IP，避免凍融破壞蛋白質間弱的相互作用）。SDS LB煮沸過的樣品凍融會存在另一個問題，SDS沉淀；SDS 4度就會沉淀，何況-80度。上樣前應加熱充分溶解，否則從加樣口向下拖帶（SDS LB不夠，樣品未充分溶解也會出現類似拖尾；上樣過大也會）。 在樣品制備過程中，另一個需要注意的問題是，從樣品制備的起始階段就要注意定量問題；WB本身系統誤差有20%，太細微的差別經常忽略不計。細胞樣品可以先計數再接種，短時間內即使細胞生長有差異也不會對WB結果影響太多。組織樣品，從腫瘤組織的大小（稱重）開始，裂解液的體積都是精確定量的，操作過程也盡量避免蛋白損失。有人會說可以電泳前蛋白定量，我將下一節討論蛋白定量的不科學性，以及裂解液成分對定量的干擾。 【補充1】：細胞有凋亡或生長速率差異時， 有一個最直接的辦法針對這個問題，實際上將細胞收集下來以后，經過離心，去除PBS，這時候你可以拿出事先準備好的標準體積去比對，誤差小于50ul的（因為標準品差值可以設定為50ul),所以基本上肉眼偏差至多只有10ul（細胞體積），這種小差別在WB結果中可以忽略不計。 其實標準品有多種好處，平時可以用于離心時平衡；可以廢物利用一些用過的effendorf管。 最好不要用純水做標準品，我喜歡稀釋一些SDS LB做標準品，因為有藍黑色對比下，可以更精確估計體積。 這相對比測標準曲線，再一一讀值還是快很多； 蛋白電泳：電泳膠的制備、配方、緩沖液配方，請參考分子克隆。經驗之談，8%膠最底邊約36KDa，10%最底邊約25KDa，12%最底部約12KDa。8%膠可以跑300KDa-36KDa之間的任意蛋白，轉膜效率對WB結果的的影響都問題不大。12%，180KDa左右，轉膜效率對WB結果的影響都問題不大（300KDa蛋白如何，沒有嘗試過）。 電泳一般采用恒流，45mA-55mA（應根據電泳儀器適當調整，要注意儀器最高限壓；此條件適合gibco model V16型，膠寬20cm）。采用恒流的優點，保證最快速度完成電泳（電壓會逐漸增大），省時且減少擴散；但是由于電泳速度過快時會發熱而溶膠，所以你必須想辦法散熱。散熱不好，條帶出現波浪狀。 (責任編輯：大漢昆侖王) |
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